旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原的研究.pdf

1、1．研究目的 研究大理豬源旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)（Trichinela spiralis adult worm）三種抗原：排泄分泌抗原（ES）、表面抗原（SA）和蟲(chóng)體可溶性抗原（BSA）的蛋白組分及其之間的差異，并進(jìn)一步分析其免疫反應(yīng)性，為分離和篩選出免疫原性和免疫反應(yīng)性強(qiáng)的旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原成分打基礎(chǔ)。由于旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)是旋毛蟲(chóng)感染的早期階段，腸道是其寄生場(chǎng)所，因此成蟲(chóng)抗原成分可能作為旋毛蟲(chóng)病口服疫苗的候選抗原成分，將對(duì)旋毛蟲(chóng)病早期免疫預(yù)防和免疫

2、診斷具有實(shí)踐意義。 2．研究方法 2．1改良貝氏法收集旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng) 2．2旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原制備:將旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)在不含血清的RPMI—1640培養(yǎng)基中于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，離心、收集上清、透析、濃縮后得到排泄分泌抗原（ES）；將旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)在含0．25%十六烷基三甲溴化銨（CTAB）及2%脫氧膽酸鈉的RPMI—1640培養(yǎng)基中37℃孵育2．5h，其間搖動(dòng)培養(yǎng)瓶1次，離心、收集上清、透析、濃縮得到表面抗原（S

3、A）；將旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)反復(fù)凍融、研磨、超聲粉碎、冷浸、離心，得到蟲(chóng)體可溶性抗原（BSA）。 2．3制備免疫血清并檢測(cè) 2．3．1陰性血清的制備:SD大鼠感染旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)前尾靜脈采血，獲得陰性血清。 2．3．2大鼠抗旋毛蟲(chóng)血清:用旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)經(jīng)口感染SD大鼠（8×103條/只），6周后，尾靜脈取血，用旋毛蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)感染旋毛蟲(chóng)大鼠血清IgG抗體效價(jià)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)得大鼠血清IgG抗體效價(jià)高達(dá)

4、1：10240，即可于乙醚麻醉下經(jīng)股動(dòng)脈取血，室溫靜置30min，3×103r/min離心5min，取上清液即為大鼠抗旋毛蟲(chóng)血清。分裝，于—20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2．4旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)三種抗原的分析以大理豬源旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)的三種抗原（排泄分泌抗原、表面抗原和蟲(chóng)體可溶性抗原）作對(duì)照，采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE），分別對(duì)成蟲(chóng)三種抗原蛋白成分進(jìn)行分析；采用蛋白印跡（Western—blot）對(duì)成蟲(chóng)抗原進(jìn)行免疫反

5、應(yīng)性分析。 3.結(jié)果 3．1旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)體外培養(yǎng)和收集結(jié)果本研究選擇10只成年SD雌性大鼠經(jīng)口食入含約500條旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)的小鼠肌肉，收集旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)40萬(wàn)條（見(jiàn)圖1）。然后選擇30只成年SD雌性大鼠，每只大鼠經(jīng)口感染8000條旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)，收集純凈成蟲(chóng)10萬(wàn)條，發(fā)現(xiàn)收集的成蟲(chóng)中雌蟲(chóng)子宮內(nèi)充滿(mǎn)新生幼蟲(chóng)，而且培養(yǎng)液中已有一定新生幼蟲(chóng)。另外培養(yǎng)液中仍有一定量的雄蟲(chóng)，表明雄蟲(chóng)交配后并未很快死亡（見(jiàn)圖2）。 3

6、．2旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原的SDS—PAGE分析結(jié)果以旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌抗原、表面抗原和蟲(chóng)體可溶性抗原作對(duì)照，對(duì)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原、表面抗原和蟲(chóng)體可溶性抗原經(jīng)SDS—PAGE分析和考馬斯亮藍(lán)R—250染色后，可見(jiàn)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原顯示29條蛋白染色條帶，分子量范圍在112kDa—10kDa之間，其中主帶13條，分子量分別為100、95、81、50、45、43、37、35、30、27、24、20、10kDa；旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體可溶性抗原顯示

7、30條蛋白染色條帶，分子量范圍在100kDa—12kDa之間，其中主帶11條，分子量分別為100、66、63、55、45、40、37、35、30、16、12kDa；旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)表面抗原顯示4條主要蛋白染色條帶，分子量分別為50、48、40、34kDa；旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)表面抗原顯示10條主要蛋白染色條帶，分子量范圍在105—28kDa之間，分子量分別為105、99、80、63、55、48、35、28、24、21kDa。旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原顯示

8、17條蛋白染色條帶，分子量范圍在120—14kDa之間，其中主帶6條，分子量分別為120、64、43、40、35、33kDa；旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌抗原顯示20條蛋白染色條帶，分子量范圍在112—10kDa之間，其中主帶11條，分子量分別為112、66、56、55、53、49、45、43、25、21、10kDa（見(jiàn)圖3） 3．3．3旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原Western—blot檢測(cè)結(jié)果Western—blot檢測(cè)結(jié)果表明，以大鼠抗旋毛蟲(chóng)血

9、清檢測(cè)時(shí)，旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體可溶性抗原可出現(xiàn)13條反應(yīng)條帶，其中分子量為81、40、37、33、30kDa的條帶著色明顯；旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)蟲(chóng)體可溶性抗原可出現(xiàn)25條反應(yīng)條帶，分子量范圍在80—10kDa之間，其中分子量為75、66、63、55、49、45、37、28、20、16kDa的條帶著色較深；旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)表面抗原出現(xiàn)4條反應(yīng)條帶，其分子量分別為50、48、40、34kDa；旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)表面抗原出現(xiàn)7條反應(yīng)條帶，分子量分別為105、99、8

10、0、55、48、35、28kDa，其中48、35kDa顯色明顯；旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原顯示7條反應(yīng)帶，其分子量分別為43、40、35、27、19、18、14kDa，其中43、40、27、18kDa著色明顯；旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌抗原顯示14條反應(yīng)帶，其分子量范圍在74—12kDa之間，其中53、49、45、43、35、27、18、12kDa顯色明顯（見(jiàn)圖4）。而陰性血清在相應(yīng)位置均無(wú)特異性反應(yīng)條帶出現(xiàn)。 4.結(jié)論 4．1．

11、旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體可溶性抗原和肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體可溶性抗原都含有分子量為45、37、35、30kDa的蛋白組分；旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體可溶性抗原中分子量為81、40、37、33、30kDa的蛋白組分能與大鼠抗旋毛蟲(chóng)血清抗體IgG發(fā)生較強(qiáng)的特異性識(shí)別。 4．2．旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)表面抗原與肌幼蟲(chóng)表面抗原都含有分子量為48kDa的蛋白組分；而且成蟲(chóng)表面抗原中分子量為50、48、40、34kDa的蛋白組分能與大鼠抗旋毛蟲(chóng)血清抗體IgG發(fā)生較強(qiáng)的特異性識(shí)別。