ES抗原和表面抗原在旋毛蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞中的作用.pdf

1、旋毛蟲(chóng)病(trichinellosis)是一種危害嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病,主要是因?yàn)樯郴蛘甙肷澈行x(chóng)幼蟲(chóng)囊包的豬肉或其它動(dòng)物肉類(lèi)及肉制品所致。含有活的旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包的動(dòng)物肉類(lèi)被宿主食入之后,在消化酶的作用下,幼蟲(chóng)在胃中從囊包內(nèi)逸出后鉆入十二指腸及空?qǐng)錾隙蔚哪c粘膜中,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間發(fā)育后再返回腸腔。在感染30～40 h內(nèi),幼蟲(chóng)經(jīng)4次蛻皮發(fā)育為成蟲(chóng),新生幼蟲(chóng)于感染后4 d開(kāi)始產(chǎn)出。產(chǎn)于腸粘膜內(nèi)的新生幼蟲(chóng)能夠侵入局部淋巴結(jié)或小靜脈

2、,然后隨淋巴和血液循環(huán)到達(dá)各器官、組織或者體腔,但只有侵入橫紋肌內(nèi)的新生幼蟲(chóng)才能進(jìn)一步發(fā)育。旋毛蟲(chóng)脫囊幼蟲(chóng)侵入小腸粘膜內(nèi)繼續(xù)發(fā)育或是被宿主從腸道中排出,是旋毛蟲(chóng)能否建立感染與致病的關(guān)鍵。由于不能在體外觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞或腸道排蟲(chóng)反應(yīng)的過(guò)程,目前對(duì)幼蟲(chóng)侵入腸粘膜以及宿主排蟲(chóng)反應(yīng)的機(jī)制均不完全清楚。
　　 在旋毛蟲(chóng)感染的過(guò)程中,肌幼蟲(chóng)的排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原與表面抗原(surface

3、antigens)直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng),是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原,在幼蟲(chóng)的侵入與發(fā)育過(guò)程中可能具有重要作用。本文將旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)與HCT-8腸上皮細(xì)胞在體外共培養(yǎng),觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)ES抗原或表面抗原免疫鼠血清對(duì)幼蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞及發(fā)育的影響。同時(shí)對(duì)旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)及其ES抗原和表面抗原與人結(jié)直腸癌細(xì)胞系-8(human coloniccarcinoma cell line-8,HCT-8)在體外共培養(yǎng)后細(xì)胞蛋白的變化進(jìn)行了

4、研究。本文研究的目的是為了尋找旋毛蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞的相關(guān)因子。
　　 材料與方法：
　　 1.旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系旋毛蟲(chóng)為河南省南陽(yáng)豬源旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis),由本教研室昆明小鼠傳代保種。健康6周齡雄性昆明小鼠、BALB/c小鼠,均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,所用細(xì)胞系為人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8細(xì)胞。
　　 2.ES抗原與表面抗原免疫BABL/c血清的制備首次免疫將ES抗原與弗氏完

5、全佐劑等體積混合后,分別采用皮下多點(diǎn)注射的方法免疫BALB/c小鼠；間隔10 d后再用等量ES抗原與弗氏不完全佐劑等體積混合后免疫第2次；間隔10 d第3次免疫,方法同第2次免疫,于免疫后6 d尾靜脈采血,分離血清,用ES抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定血清抗體滴度,當(dāng)抗體滴度達(dá)104以上時(shí),于第3次免疫后10 d加強(qiáng)免疫1次,方法同第2次免疫,7 d后眶竇靜脈采

6、血,分離血清。表面抗原免疫血清的制備方法同ES抗原免疫血清,ES抗原與表面抗原每次免疫小鼠的劑量均為20μg/只。ELISA檢測(cè)ES抗原、表面抗原免疫鼠血清抗體滴度。
　　 3.旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的激活將新鮮的肌幼蟲(chóng)用含5％牛膽汁的無(wú)菌生理鹽水在37℃5％CO2條件下孵育2 h,用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后,在含抗生素的生理鹽水(100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)中37℃孵育1 h備用。
　　 4.肌幼蟲(chóng)在腸上皮細(xì)胞單

7、層中發(fā)育情況的觀(guān)察將激活后肌幼蟲(chóng)懸浮在半固體培養(yǎng)基中后鋪入培養(yǎng)的HCT-8細(xì)胞單層,37℃5％CO2條件下培養(yǎng)不同時(shí)間后在倒置顯微鏡下觀(guān)察肌幼蟲(chóng)體外發(fā)育情況。
　　 5.免疫血清對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞及其發(fā)育的影響將ES抗原或表面抗原免疫鼠血清與半固體培養(yǎng)基按1:10充分混合后,加入激活后的肌幼蟲(chóng),然后覆蓋到培養(yǎng)的HCT-8細(xì)胞表面,37℃5％CO2條件下培養(yǎng)不同時(shí)間觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的形態(tài)及發(fā)育。培養(yǎng)36 h后除去半固體培養(yǎng)基,收

8、集肌幼蟲(chóng),間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay,IFA)觀(guān)察旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)蛻皮情況,計(jì)數(shù)1期及2～4期幼蟲(chóng)數(shù)。
　　 6.HCT-8細(xì)胞與ES抗原或表面抗原孵育后IFA檢測(cè)將ES抗原或表面抗原添加到培養(yǎng)基中,與HCT-8細(xì)胞共孵育2 h后,IFA檢測(cè)細(xì)胞表面熒光情況,同時(shí)設(shè)立正常HCT-8細(xì)胞作為對(duì)照。
　　 7.HCT-8細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blo

9、t鑒定將激活的肌幼蟲(chóng)和培養(yǎng)基按照5000條/ml比例混合后加到HCT-8細(xì)胞表面,37℃5％CO2條件下培養(yǎng)18 h后,PBS洗去肌幼蟲(chóng),0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化收集HCT-8細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白,利用十二烷基磺酸鈉.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及蛋白質(zhì)印跡(Western blot)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.肌幼蟲(chóng)在腸上皮細(xì)胞單層中的發(fā)育情況旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)培養(yǎng)12 h時(shí)頭尾端未見(jiàn)脫鞘；1

10、8 h在幼蟲(chóng)尾端可見(jiàn)鞘的形成；24 h可見(jiàn)幼蟲(chóng)部分蛻皮,但未蛻下完整表皮；36 h幼蟲(chóng)已蛻下一層完整的表皮；48 h可見(jiàn)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)第二層鞘的形成；72 h可見(jiàn)幼蟲(chóng)脫下2層完整的表皮；84 h可以看到旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)包裹在3層鞘內(nèi)；96 h可見(jiàn)到早期雄蟲(chóng),在其尾端能夠看到交配附器。
　　 2.免疫血清對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞及其發(fā)育的影響旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在含ES抗原或表面抗原免疫血清的半固體培養(yǎng)基+HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)15min后,發(fā)現(xiàn)ES免疫血

11、清組的部分幼蟲(chóng)頭端有帽樣結(jié)構(gòu)形成,旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清對(duì)照組部分幼蟲(chóng)頭端也有帽樣結(jié)構(gòu)；表面抗原免疫血清組、正常小鼠血清對(duì)照組的幼蟲(chóng)均未觀(guān)察到帽樣結(jié)構(gòu)。在未加血清的半固體培養(yǎng)基+HCT-8細(xì)胞中培養(yǎng)的幼蟲(chóng)也未發(fā)現(xiàn)帽樣結(jié)構(gòu)。少數(shù)帶有頭端帽樣結(jié)構(gòu)的幼蟲(chóng)可移行到細(xì)胞單層,多數(shù)仍停留在半固體培養(yǎng)基中,但均不能侵入腸上皮細(xì)胞單層中。幼蟲(chóng)在含不同血清的半固體培養(yǎng)基+HCT-8細(xì)胞中發(fā)育至2-4期幼蟲(chóng)百分比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=178.3,P<0.0

12、5),在含旋毛蟲(chóng)感染鼠血清、ES抗原及表面抗原免疫鼠血清條件下發(fā)育至2-4期幼蟲(chóng)的百分比分別為1.17％(1/86)、2.25％(2/89)、2.2％(3/91),均明顯低于含正常鼠血清條件下培養(yǎng)的幼蟲(chóng)百分比為24.74％(22/97)(x12=77.6,x22=74.6,x32=66.9,P<0.05),但在感染鼠血清、ES抗原及表面抗原免疫鼠血清條件下發(fā)育至2-4期幼蟲(chóng)百分比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=2.14,P>0.05)。

13、>　　 3.IFA觀(guān)察ES抗原和表面抗原與HCT-8細(xì)胞的結(jié)合情況正常HCT-8細(xì)胞與ES抗原免疫血清、表面抗原免疫血清及旋毛蟲(chóng)感染鼠血清均為陽(yáng)性反應(yīng),呈現(xiàn)綠色熒光,但與正常鼠血清為陰性反應(yīng)。HCT-8細(xì)胞經(jīng)ES抗原孵育后,與ES抗原免疫血清及旋毛蟲(chóng)感染鼠血清均為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),呈現(xiàn)亮綠色熒光,與正常鼠血清仍為陰性反應(yīng)；HCT-8細(xì)胞經(jīng)表面抗原孵育后,與表面抗原免疫血清及旋毛蟲(chóng)感染鼠血清均為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),與正常鼠血清仍為陰性反應(yīng)。
　

14、　 4.HCT-8細(xì)胞與肌幼蟲(chóng)孵育后細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)果表明,正常的HCT-8細(xì)胞有30條蛋白帶,分別為131、118、108、104、96、90、85、80、74、72、68、66、61、57、53、48、46、45、43、39、37、34、32、29、28、25、24、21、20、15kDa。HCT-8細(xì)胞與幼蟲(chóng)孵育后的細(xì)胞蛋白增加了3條蛋白帶,分別為38、36、17kDa,但減少了1條72kDa的

15、蛋白帶。
　　 5.HCT-8細(xì)胞與幼蟲(chóng)孵育后細(xì)胞蛋白的Western blot分析結(jié)果Western blot結(jié)果顯示,正常HCT-8細(xì)胞的蛋白能夠被旋毛蟲(chóng)感染鼠血清識(shí)別的有14條帶,分別為131、90、68、53、48、46、45、44、39、34、32、29、25、23kDa,HCT-8細(xì)胞與肌幼蟲(chóng)孵育后的細(xì)胞蛋白能夠被旋毛蟲(chóng)感染鼠血清識(shí)別的有16條帶,分別為131、90、68、66、61、57、53、48、46、45、3

16、9、34、32、29、25、17 kDa。HCT-8細(xì)胞與肌幼蟲(chóng)孵育后與正常細(xì)胞相比,被旋毛蟲(chóng)感染鼠血清多識(shí)別了4條蛋白帶(66、61、57、17 kDa),少識(shí)別了2條蛋白帶(44、23kDa)；正常HCT-8細(xì)胞蛋白能被表面抗原免疫血清識(shí)別的有6條帶,分別為48、46、34、32、29、23kDa,HCT-8細(xì)胞與幼蟲(chóng)孵育后的細(xì)胞蛋白能被表面抗原免疫血清識(shí)別的也有6條帶,分別為48、46、45、34、32、29kDa。HCT-8細(xì)胞

17、與幼蟲(chóng)孵育后與正常細(xì)胞相比,被表面抗原免疫血清多識(shí)別了1條45kDa蛋白帶,少識(shí)別了1條23kDa蛋白帶；正常HCT-8細(xì)胞蛋白能夠被ES抗原免疫血清識(shí)別的有3條帶,分別為90、48、43kDa:細(xì)胞與幼蟲(chóng)孵育后的細(xì)胞蛋白能夠被ES抗原免疫血清識(shí)別的有6條帶,分別為90、45、43、34、21、17kDa。HCT-8細(xì)胞與幼蟲(chóng)孵育后與正常細(xì)胞相比,被ES抗原免疫血清多識(shí)別了4條蛋白帶(45、34、21、17kDa),少識(shí)別了1條蛋白帶(