旋毛蟲抗原對Toll樣受體作用及雙抗體夾心ELISA檢測方法建立.pdf

1、旋毛蟲排泄分泌抗原（excretory-secretory antigen，ES抗原），是一類由旋毛蟲蟲體分泌排泄而產(chǎn)生，可以進(jìn)入宿主機(jī)體，直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原物質(zhì)。可用于疾病診斷、疫苗以及免疫機(jī)制等方面的研究。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）家族具有模式識別受體的功能，通過識別病原體的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associatedmolecular patter

2、ns，PAMPs），也稱為TLRs的配體或激動(dòng)劑，構(gòu)成了機(jī)體抗感染的第一道防線，在固有免疫中起著重要作用。TLRs能識別多種抗原，如內(nèi)源性的熱休克蛋白，及多種外源性抗原。HSP70是一類最保守的熱休克蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性。
　　 本研究采用體外培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲方法制備E S抗原，用于免疫小鼠制備單克隆抗體，經(jīng)過三輪篩選篩，得到2株穩(wěn)定分泌抗旋毛蟲肌幼蟲ES抗原抗體的雜交瘤細(xì)胞株，2株細(xì)胞分泌抗體亞型均屬于IgG類。選取其中A

3、11細(xì)胞株制備腹水并純化，純化后腹水效價(jià)為1∶2.1×105，純化后單抗?jié)舛葹?.8mg/ml。Western Blot結(jié)果顯示單抗A11可識別ES抗原中43、49、53kDa三條蛋白帶。
　　 用 ES抗原免疫家兔制備兔抗ES抗原多抗并純化，純化后血清效價(jià)為1∶1.2×106,純化后多抗血清蛋白濃度為8.8mg/ml。用單克隆抗體作為捕獲抗體，以多抗為檢測抗體，建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法。經(jīng)方陣法確定單抗最佳工作濃度為

4、7.6μl/ml(1∶500)，多抗?jié)舛葹?.4μl/ml(1∶2000)。該檢測方法對常見寄生蟲抗原如日本血吸蟲、弓形蟲、豬鞭蟲、豬囊尾蚴、豬蛔蟲、華枝睪吸蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、前后盤吸蟲均無交叉反應(yīng)。本方法對ES抗原最小檢出量為12ng/ml。檢測肌幼蟲24h培養(yǎng)液上清，5蚴/ml即可檢測出ES抗原。將蟲體進(jìn)行超聲破碎檢出量為0.25蚴/ml。通過對感染旋毛蟲小鼠不同時(shí)間血清進(jìn)行檢測，在感染后7d即可檢測出循環(huán)抗原。
　　 利用

5、制備的單抗A11結(jié)合免疫親和層析法，對旋毛蟲肌幼蟲ES抗原進(jìn)行提純，之后進(jìn)行SDS-PAGE分析，可見分子量大小約為43、49、53kDa的三條混合蛋白帶，混合蛋白濃度為0.34mg/ml。
　　 根據(jù)GenBank中登錄的TLR2、TLR4序列，設(shè)計(jì)并合成引物，采用RT-PCR方法從小鼠巨噬細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增TOLL樣受體2（mTLR2）和TOLL樣受體4(mTLR4)基因，得到基因全長CDS，經(jīng)克隆測序正確后分別構(gòu)建真核表達(dá)

6、質(zhì)粒pcDNA3.1-mTLR2和pcDNA3.1-mTLR4。重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，用RT-PCR與免疫熒光檢測其表達(dá)及細(xì)胞定位，結(jié)果顯示mTLR2轉(zhuǎn)染后成功表達(dá)并定位于細(xì)胞膜。利用 TLR2激活物pam3csk4和TLR4激活物L(fēng)PS分別刺激轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞后，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析其下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果經(jīng)刺激后TLR2和TLR4熒光素酶活性顯著高于生理鹽水對照組，說明表達(dá)的mT

7、LR2和mTLR4具有野生型分子的功能。
　　 分別取三種旋毛蟲抗原:旋毛蟲ES抗原、經(jīng)單抗親和純化得到的43、49、53kDa混合蛋白及原核表達(dá)的旋毛蟲HSP70蛋白，分別加入轉(zhuǎn)染了mTLR2或mTLR4的HEK293T細(xì)胞。結(jié)果顯示:旋毛蟲ES抗原和經(jīng)單抗純化得到的43、49、53kDa混合蛋白都與mTLR2和mTLR4受體直接作用，激活下游NF-κB通路，原核表達(dá)的旋毛蟲HSP70蛋白則僅能激活mTLR2受體的NF-κB通