枯草溶菌素轉換酶9基因新突變的發(fā)現(xiàn)及其功能初步研究.pdf

1、研究背景：
　　家族性高膽固醇血癥(familia hypercholesterlolemia, FH)是顯性遺傳代謝性疾病,可由多種脂代謝相關基因突變所導致。家系遺傳分析研究證實低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDL-R)、枯草溶菌素轉換酶9(proprotein convertase subtilisin kexin9,PCSK9)等基因突變引發(fā)LDL-R功能障礙均可導致相同

2、的臨床表型:純合子發(fā)病率1/百萬,血漿LDL膽固醇大幅度增高導致早發(fā)動脈粥樣硬化,兒童期即可導致嚴重的冠心病而死亡。雜合子發(fā)病率1/500,出生時即有 LDL-R的功能障礙,機體長期暴露于高膽固醇水平,動脈硬化進展加速。通常50％男性患者在50歲之前、30%女性在60歲之前發(fā)生心梗,在小于60歲的心?；颊逨H雜合子患者中約占5%。在已知的致病基因中LDL-R基因突變最為常見,約占FH病例的50%-70%,其它5種突變約占20%。然而,在

3、FH患者中仍有約10-15%檢測不到上述6種致病基因突變,推測尚有一些新的致病基因有待發(fā)現(xiàn)
　　隨著近年對PCSK9基因研究的不斷深入,人們對LDL-膽固醇的代謝機制又有了新的認識。最新研究結果發(fā)現(xiàn)PCSK9基因?qū)DL-R代謝有重要調(diào)節(jié)作用;同為 PCSK9基因的不同位點突變可導致完全相反的兩種現(xiàn)象:PCSK9功能獲得性突變與高膽固醇血癥有關;PCSK9功能喪失突變與低膽固醇血癥有關。本課題從一個FH家系入手,篩查致病突變,并于

4、體外研究突變體功能,探討該突變體作用機制,為高膽固醇血癥的臨床診斷及脂質(zhì)代謝的機制提供新的線索。
　　第一部分：家族性高膽固醇血癥患者臨床資料分析及基因突變篩查
　　[目的]：
　　篩查中國漢族家族性高膽固醇血癥家系中的基因突變新類型,分析基因型與表型間的關系。
　　[方法]：
　　以一 FH家系為研究對象,詳細調(diào)查患者飲食、生活習慣及家族史并進行心血管系統(tǒng)全面檢查;提取外周血白細胞 DNA,核苷酸序列測定

5、法對一個漢族FH家系 LDL-R、apoB和PCSK9基因進行突變檢測;采用蛋白分析系統(tǒng)ExPASy預測PCSK9基因野生型和R306S突變體編碼蛋白的二、三級結構。
　　[結果]：
　　1、該FH家系先證者體檢顯示心血管系統(tǒng)嚴重動脈粥樣硬化性改變,心臟缺血性損傷;2、LDL-R和apo B100基因未見突變;核苷酸序列測定法發(fā)現(xiàn)先證者及其父親PCSK9基因第918位核苷酸G T改變,導致第6外顯子第306位精基酸被絲氨酸取

6、代;3、蛋白質(zhì)二、三級結構的模擬發(fā)現(xiàn),與野生型相比, PCSK9基因發(fā)生R306S突變后編碼蛋白梭基末端結構域和催化亞基結構域兩個主要的部分構像發(fā)生改變,且這2個結構域之間的距離拉大。
　　[結論]：
　　1.在一漢族FH家系中發(fā)現(xiàn)PCSK9基因新錯義突變R306S;
　　2.計算機結構模擬分析發(fā)現(xiàn)新突變體 R306S編碼蛋白二、三級結構發(fā)生改變。
　　第二部分：枯草溶菌素轉換酶9基因新突變體表達及功能初步研究<

7、br>　　[目的]：
　　探討枯草溶菌素轉換酶9基因新突變對LDL代謝的作用及突變致FH的分子機制,并為突變患者采取早期治療,防治心血管疾病發(fā)生和擴展LDL的代謝機制等提供理論和實驗依據(jù)。
　　[方法]：
　　從人肝腫瘤細胞系 BEL-7402細胞獲得野生型 PCSK9基因全長cDNA(WT-PCSK9);構建真核表達載體并經(jīng)核苷酸序列測定法鑒定;定點突變方法構建攜帶PCSK9基因致病型的重組真核表達質(zhì)粒并測序及酶切法

8、鑒定插入片段的大小及序列;以空白載體為對照,脂質(zhì)體轉染法將重組質(zhì)粒轉染BEL-7402細胞;RT-PCR檢測LDL-R mRNA表達,Western blot檢測PCSK9和LDL-R蛋白表達;荷脂實驗觀察對LDL代謝的影響;免疫熒光觀察PCSK9基因與LDL-R細胞共定位;流式細胞法檢測轉染細胞LDL-R對熒光標記LDL的結合能力的變化;穩(wěn)定轉染肝細胞系,建立Tet on/off系統(tǒng),定量觀察PCSK9基因?qū)DL-R表達的影響。

9、r>　　[結果]：
　　1、核苷酸序列測定法鑒定證實構建的表達載體插入片段大小和序列正確。2、各突變體轉染BEL-7402細胞LDL-R mRNA水平與野生型比較無明顯差異(p>0.05)。3、Western blot檢測各突變體轉染BEL-7402細胞PCSK9前體蛋白和成熟蛋白無明顯差異(p>0.05);與對照組比較,轉染野生型PCSK9質(zhì)粒后LDL-R成熟蛋白表達降低(p<0.05);轉染陽性對照質(zhì)粒后成熟LDL-R條帶消失

10、表達明顯降低( p<0.01);轉染 R306S突變體后成熟 LDL-R降低(p<0.01)。4、荷脂實驗結果顯示,與空白對照相比,PCSK9野生型肝細胞內(nèi)脂質(zhì)減少(p<0.05);R306S組肝細胞脂質(zhì)減少明顯(p<0.01),且低于野生型PCSK9 BEL肝細胞(p<0.05)。5、免疫熒光檢測肝細胞PCSK9與LDL-R共定位,轉染前后分別主要位于細胞膜和胞內(nèi)。6、流式細胞法檢測轉染細胞LDL-R對熒光標記 LDL的結合活性的變化

11、,與空白對照組細胞相比野生型PCSK9組熒光強度降低(p<0.05),陽性對照F216R組平均熒光降低更為明顯(p<0.01),新突變體組平均熒光強度降低程度較野生型明顯(p<0.01)。7、突變體Tet on系統(tǒng)在BEL-7402細胞中高效、穩(wěn)定表達。在PCSK9野生型及突變體Tet on系統(tǒng)中隨著Doxycycline藥物濃度的增加,PCSK9野生型和突變體開始表達,且表達量逐漸升高,LDL-R成熟蛋白部分逐漸減少,未糖基化的LDL

12、-R未見顯著變化;與野生型相比,R306S降低成熟LDL-R的能力顯著提高(p<0.05)。
　　[結論]：
　　1.成功構建PCSK9基因野生和突變類型的真核表達載體;
　　2.體外實驗中發(fā)現(xiàn)PCSK9基因新突變體R306S對LDL-R的轉錄無顯著影響;
　　3.PCSK9基因新突變體R306S可明顯降低細胞LDL-R成熟蛋白水平;
　　4.PCSK9基因新突變體R306S可減少其對LDL的攝取從而引發(fā)高