TMEM43基因定點(diǎn)突變克隆構(gòu)建及其功能初步分析.pdf

1、目的:通過構(gòu)建TMEM43基因點(diǎn)突變真核表達(dá)載體，并將TMEM43基因點(diǎn)突變真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察真核表達(dá)情況，同時(shí)采用生物信息學(xué)方法分析TMEM43基因的生物學(xué)功能，然后分析轉(zhuǎn)染野生型與突變型TMEM43心肌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡狀況。
　　方法：:通過克隆PCR、酶切和定向連接等DNA重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體pTMEM43-EGFP-N1。表達(dá)載體pTMEM43-EGFP-N1用SDM定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建TMEM43點(diǎn)突

2、變真核表達(dá)載體p-mutTMEM43-EGFP-N1。將野生型和突變型TMEM43基因克隆分別轉(zhuǎn)化DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性菌落，挑取陽(yáng)性菌落，培菌擴(kuò)增，小制備方法提取質(zhì)粒DNA，并純化質(zhì)粒DNA。經(jīng)Age I和Xho I單酶切或雙酶切，根據(jù)酶切后DNA電泳結(jié)果剔除假陽(yáng)性克隆。經(jīng)酶切鑒定后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，用測(cè)序儀進(jìn)行核苷酸測(cè)序。經(jīng)測(cè)序的序列經(jīng)比對(duì)后確認(rèn)TMEM43基因點(diǎn)

3、突變的發(fā)生。將測(cè)序證實(shí)的點(diǎn)突變克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，擴(kuò)菌后，用大提法制備去除內(nèi)毒素的野生型和突變型跨膜蛋白TMEM43克隆質(zhì)粒，備用。小鼠心肌細(xì)胞株HL-1細(xì)胞用含10％胎牛血清的Claycomb培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)胰蛋白酶消化和更新培養(yǎng)基后進(jìn)行HL-1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。用于顯微觀察的細(xì)胞貼附生長(zhǎng)于小玻片上，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，將野生型和突變型TMEM43分別轉(zhuǎn)染HL-1細(xì)胞株，24小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察小玻片上H

4、L-1細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況。用于蛋白免疫印跡分析的細(xì)胞，傳代培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后24-36小時(shí)，用細(xì)胞刮子收集貼附生長(zhǎng)細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。采用生物信息學(xué)的方法分析TMEM43蛋白質(zhì)的與結(jié)構(gòu)、點(diǎn)突變效應(yīng)預(yù)測(cè)等。分別用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染野生型和突變型TMEM43的HL-1細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1．構(gòu)建的真核表達(dá)載體pTMEM43-EGFP-N1的酶切鑒定結(jié)果符合預(yù)期，即Age I和

5、Xho I單酶切產(chǎn)生大小為5.7kb左右的線型DNA片斷，而Age I和Xho I雙酶切則產(chǎn)生大小分別為4.3kb和1.3kb的線型DNA片斷。
　　2．對(duì)含有野生型TMEM43基因的質(zhì)粒pTMEM43-EGFP-N1通過定點(diǎn)突變技術(shù)，經(jīng)突變誘導(dǎo)PCR后，經(jīng)Dpn酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化和篩選，對(duì)質(zhì)粒DNA用Xho I限制酶消化，電泳后結(jié)果顯示，突變體DNA產(chǎn)生清晰的大小為5.7kb的片斷。
　　3．將突變體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后，接

6、種于青霉素和卡那霉素雙選培養(yǎng)板，經(jīng)37℃孵育18小時(shí)后挑取陽(yáng)性菌落。陽(yáng)性菌落經(jīng)液體培養(yǎng)基擴(kuò)菌后，用小提質(zhì)粒DNA方法提取質(zhì)?；蚪MDNA，經(jīng)酶切后電泳結(jié)果顯示有3個(gè)菌落符合預(yù)期。
　　4．對(duì)符合預(yù)期的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果證實(shí)C>T的生成。
　　5．經(jīng)過酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)的突變體p-mutTMEM43-EGFP-N1繼續(xù)進(jìn)行大量擴(kuò)增和采用大提質(zhì)粒DNA的方法提取不含內(nèi)毒素和致熱原的DNA，經(jīng)酶切確認(rèn)，再進(jìn)行質(zhì)粒全基因組測(cè)

7、序，結(jié)果顯示序列全部正確。
　　6．應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別用野生型TMEM43和突變型TMEM43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠心肌來源的細(xì)胞株HL-1細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到野生型和突變型均能夠成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，兩者在在細(xì)胞內(nèi)定位沒有明顯差異。
　　7．對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示，野生型和突變型TMEM43均有良好的表達(dá)。
　　8．細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，野生型與突變型TMEM43轉(zhuǎn)染細(xì)胞

8、后，細(xì)胞增殖沒有顯著差異。
　　9．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染野生型和突變型TMEM43基因的HL-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染突變型的細(xì)胞凋亡水平顯著高于轉(zhuǎn)染野生型的細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染突變型TMEM43基因的細(xì)胞，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)水平增加，而Bcl2蛋白表達(dá)水平降低。
　　結(jié)論：
　　1.在TMEM43基因中成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了1073C>T點(diǎn)突變。
　　2.構(gòu)建的真核表達(dá)載體可有效轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)染突變型TMEM