橋粒斑蛋白定點(diǎn)突變克隆構(gòu)建及真核轉(zhuǎn)染.pdf

1、目的:
　　1.構(gòu)建DSP基因點(diǎn)突變真核表達(dá)載體。
　　2.將DSP基因點(diǎn)突變真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察真核表達(dá)情況。
　　方法:
　　1.質(zhì)粒pDSP-EGFP-N1用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建橋粒斑蛋白點(diǎn)突變真核表達(dá)載體p-mutDSP3925-EGFP-N1。將野生型和突變型橋粒斑蛋白基因克隆分別轉(zhuǎn)化DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性菌落,挑取陽(yáng)性菌落,搖菌擴(kuò)增,小制備提取質(zhì)粒,并純化質(zhì)粒。經(jīng)Xba

2、 I和Age I單酶切或雙酶切,根據(jù)酶切后DNA電泳結(jié)果剔除假陽(yáng)性克隆。經(jīng)酶切鑒定后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR測(cè)序反應(yīng),測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,用測(cè)序儀進(jìn)行核苷酸測(cè)序。測(cè)序序列經(jīng)比對(duì)后確認(rèn)DSP基因點(diǎn)突變發(fā)生。將測(cè)序證實(shí)的點(diǎn)突變克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,擴(kuò)菌后,用大提法制備野生型和突變型橋粒斑蛋白克隆質(zhì)粒,備用。N2A細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng),胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。用于顯微觀察的細(xì)胞貼附生長(zhǎng)于小玻片上,應(yīng)用Lipofectamine20

3、00轉(zhuǎn)染試劑,將野生型和突變型DSP分別轉(zhuǎn)染N2A細(xì)胞株,24小時(shí)后,在熒光顯微鏡下觀察小玻片上N2A細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況。用于蛋白分析的細(xì)胞,傳代培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中,細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后24-36小時(shí),用細(xì)胞刮子收集貼附生長(zhǎng)細(xì)胞,裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白,用免疫共沉淀方法鑒定突變體功能改變。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建的真核表達(dá)載體pDSP-EGFP-N1的酶切鑒定結(jié)果符合預(yù)期,即Age I和Xho I單酶切產(chǎn)生產(chǎn)生大小為13kb左右的線

4、型DNA片斷,而Age I和Xho I雙酶切則產(chǎn)生大小分別為8kb、4kb和1kb的線型DNA片斷。
　　2.采取健康青年人的全血,對(duì)提取的基因組DNA用PCR擴(kuò)增DSP基因3646A>G點(diǎn)突變區(qū)域的DNA片斷,經(jīng)Acl I限制酶消化后進(jìn)行電泳,結(jié)果顯示所檢測(cè)的120份樣品沒(méi)有出現(xiàn)酶切片斷的產(chǎn)生。
　　3.對(duì)含有野生型DSP基因的質(zhì)粒pDSP-EGFP-N1通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù),經(jīng)突變誘導(dǎo)PCR后,對(duì)PCR產(chǎn)物用Xho I限制酶

5、消化,電泳后結(jié)果顯示,突變體DNA產(chǎn)生清晰的大小為13.5kb的片斷。
　　4.將突變體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后,接種于青霉素和卡那霉素雙選培養(yǎng)板,經(jīng)37℃孵育18小時(shí)后挑取陽(yáng)性菌落。陽(yáng)性菌落經(jīng)液體培養(yǎng)基擴(kuò)菌后,用小提質(zhì)粒DNA方法提取的質(zhì)粒基因組DNA,酶切后電泳結(jié)果顯示3個(gè)菌落符合預(yù)期。
　　5.對(duì)符合預(yù)期的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定,測(cè)序結(jié)果證實(shí)A>G的生成。
　　6.經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)的突變體p-mutDSP3925-E

6、GFP-N1繼續(xù)進(jìn)行大量擴(kuò)增和采用大提質(zhì)粒DNA的方法提取不含內(nèi)毒素和致熱原的DNA,經(jīng)酶切確認(rèn),再進(jìn)行質(zhì)粒全基因組測(cè)序的結(jié)果顯示序列全部正確。
　　7.應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別用野生型DSP和突變型DSP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤來(lái)源的細(xì)胞株N2A細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察到野生型和突變型均能夠成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞,但突變型DSP在細(xì)胞內(nèi)定位集中在胞內(nèi)區(qū)域,而野生型DSP分布于胞膜區(qū)域。
　　8.對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞