NR4A1基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的:克隆小鼠孤兒核受體(NR4A1)基因全長cDNA的讀碼框，構(gòu)建攜帶NR4A1基因的重組真核表達(dá)載體，為研究其在心肌細(xì)胞中的功能做準(zhǔn)備。
　　 方法:從Pax-8敲除的小鼠心肌組織提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR法擴(kuò)增，將目的產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，測序分析正確后，再以相同PCR方法擴(kuò)增，將其與真核表達(dá)載體pIERS2-ZsGreen1連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)限制性酶切及測序鑒定后，利用L

2、ipofectamine2000將重組載體pIERS2-ZsGreen1-NR4A1轉(zhuǎn)染到H9C2心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分三組:①PZ-NR4A1組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.2μg pIERS2-ZsGreen1-NR4A1重組載體;②NC組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.2μgpIERS2-ZsGreen1空載體;③BC組:給予的常規(guī)培養(yǎng)液，未做其他處理。并用RT-PCR法和Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后NR4A1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果

3、:成功構(gòu)建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染重組載體到細(xì)胞后，相比BC組（1.00±0.00）和NC組（0.99±0.16），PZ-NR4A1組（2.62±0.21）NR4A1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，而BC組和NC組mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PZ-NR4A1組（0.72±0.11）NR4A1蛋白的表達(dá)量與BC組（0.17±0.07）和NC組（0.21±0.08）