人NKp30基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、一、立題依據(jù)和目的 NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)抗腫瘤和病毒感染的第一道防線。在人類，NK細(xì)胞能有效的殺傷HLA-Ⅰ類分子表達(dá)減少或缺失的異常細(xì)胞。腫瘤或病毒感染常會使HLA-Ⅰ類分子表達(dá)下調(diào)，因而腫瘤或病毒感染細(xì)胞能被殺傷和裂解。NK細(xì)胞識別正常細(xì)胞和HLA-Ⅰ類分子的能力是由于克隆性分布的HLA-Ⅰ類分子特異的抑制性受體的表達(dá)，通過募集特異性磷酸酶(SHP-1和SHP-2)阻斷活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。所有抑

2、制性受體的一般結(jié)構(gòu)特性是由它們胞漿內(nèi)免疫受體酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitingMotifs,ITIM)決定的。抑制性受體分屬兩種不同的受體家族，免疫球蛋白超家族(Ig-SF)和C型凝集素超家族。不同的殺傷抑制性受體(KIR)都屬于Ig-SF,它們特異性識別不同的HLA-Ⅰ類等位基因群。KIR的編碼基因定位于19號染色體長臂19q13.42一個叫作白細(xì)胞受體復(fù)合體(Leukocyt

3、eReceptorComplex,LRC)的區(qū)域[6，7]。CD94/NKG2A異二聚體屬于C型凝集素家族抑制性受體，它特異性識別非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子HLA-E，CD94/NKG2A編碼基因定位于12號染色體長臂12q12-13一個稱為NK基因復(fù)合體的區(qū)域。 重要的是，HLA-Ⅰ類分子特異的抑制性受體通過競爭性下調(diào)不同活化受體的功能阻斷NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。直到最近幾年，負(fù)責(zé)使NK細(xì)胞活化的活化受體才得到定義和分子闡明，主

4、要包括活化殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killerimmunogloblin-likereceptors，KIRs)、自然細(xì)胞毒受體(Naturalcytotoxicityreceptors,NCRs)和一些協(xié)同活化受體。活化KIRs是HLA-Ⅰ類分子特異的活化受體，對HLA-Ⅰ類分子陰性的靶細(xì)胞的裂解不起作用。自然細(xì)胞毒受體包括NKp46、NKp30、NKp44，它們只表達(dá)于NK細(xì)胞，因此它們是識別NK細(xì)胞的最準(zhǔn)確標(biāo)志。另外一個在NK介

5、導(dǎo)的對一些腫瘤的裂解和細(xì)胞毒作用中起作用的表面受體是NKG2D—屬于NKG2家族的細(xì)胞表面受體(以含有凝集素樣區(qū)域?yàn)樘卣鞯蘑蛐湍さ鞍?。NKG2D也表達(dá)于T細(xì)胞亞群，是壓力誘導(dǎo)的MICA/B或ULBP蛋白特異的。NK細(xì)胞表達(dá)的別的活化表面分子好象主要作為協(xié)同受體起作用。包括2B4、NTB-A、NKp80、CD59和DNAM-1。DNAM-1配體已經(jīng)鑒定包括脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR，CD155)和Nectin-2(CD112)(也就是說

6、，凝集素家族的兩個成員也參與了細(xì)胞間的黏附和粒/淋巴細(xì)胞的滲出)。 NK細(xì)胞表達(dá)的三個直接參與自然細(xì)胞毒作用的受體，統(tǒng)稱為NCRs。NCRs的共同特征是它們選擇性表達(dá)于NK細(xì)胞并以HLA-Ⅰ類分子非依賴的方式誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化。另外，用單克隆抗體干擾NCR和配體的識別可導(dǎo)致自然殺傷作用的抑制。另外一個重要的特征是在生理情況下，NCR誘導(dǎo)的NK細(xì)胞活化受HLA-Ⅰ類分子特異的抑制性受體的負(fù)調(diào)節(jié)。很顯然目前為止所識別的NCR在NK細(xì)胞

7、殺傷不同類型的腫瘤靶細(xì)胞中起著協(xié)同促進(jìn)作用。這證實(shí)自然殺傷作用是NK細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的多種受體和配體之間相互作用的結(jié)果。盡管NCRs識別的分子配體還沒有識別，已經(jīng)有描述NKp46和NKp44識別流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素神經(jīng)酰胺酶病毒蛋白。 NKp46是第一個識別的NCR，它選擇性的表達(dá)于所有靜息和活化的NK細(xì)胞。它代表自然殺傷(有關(guān))的主要受體，它的單克隆抗體介導(dǎo)的交聯(lián)會誘導(dǎo)Ca2+動員和細(xì)胞因子釋放。NKp46參與不同

8、靶細(xì)胞的裂解，包括同系、同種和異種起源的正常和腫瘤細(xì)胞。特別的是，(發(fā)現(xiàn))NKp46參與NK介導(dǎo)的對大多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，這些腫瘤細(xì)胞分屬不同的組織類型包括肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤和EBV感染細(xì)胞株。NKp46在不同的NK細(xì)胞和不同的個體表達(dá)量不同。NK介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的重要性與NKp46在細(xì)胞表面的表達(dá)水平高低有關(guān)，暗示NKp46在自然殺傷作用中起著關(guān)鍵作用。NKp46以胞外區(qū)有兩個C2型免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，跨膜區(qū)含

9、有精氨酸殘基，與CD3ζ和FcεRIγ相連，與受體結(jié)合后會出現(xiàn)酪氨酸磷酸化，啟動信號傳導(dǎo)。NKp46的編碼基因定位于人染色體19q13.42稱為淋巴細(xì)胞受體復(fù)合體的區(qū)域，KIR多基因家族端粒區(qū)，NKp46基因也存在于嚙齒類和靈長類。 NKp30與NKp46有一些共同的特征。特別的是，NKp30選擇性的表達(dá)于靜息或活化的NK細(xì)胞，單克隆抗體介導(dǎo)的交聯(lián)誘導(dǎo)Ca2+流動，產(chǎn)生殺傷作用和產(chǎn)生細(xì)胞因子。NKp30是一個分子量為30KD的糖

10、蛋白，屬于Ig-SF，胞外區(qū)有一個與CD3ζ多肽相連的IgV樣區(qū)域。并且跨膜區(qū)含有精氨酸殘基。NKp30通過與CD3ζ鏈結(jié)合傳遞激活信號。NKp30基因定位于人染色體6p21.32，在LTB(淋巴毒素-β或TNF超家族成員-3)和AIF1(同種異體炎癥因子1)基因之間的HLA-Ⅲ類分子的端粒區(qū)。NKp30基因也存在與短尾猿和大鼠，而在小鼠只鑒定發(fā)現(xiàn)了其假基因。 與NKp46和NKp30受體不同的是，NKp44選擇性的表達(dá)于IL-

11、2活化的NK細(xì)胞，因此是活化NK細(xì)胞的最佳表面標(biāo)志。這揭示活化NK細(xì)胞比靜息NK細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)可能與NKp44有關(guān)。NKp44是另外一個像NKp30一樣的Ig-SF成員，胞外區(qū)含有一個IgV樣結(jié)構(gòu)。跨膜區(qū)含有帶電酪氨酸殘基，可能參與NKp44與KARAP/DAP12多肽的結(jié)合。編碼NKp44的基因定位于人染色體6p21.1，與TREM-1和TREM-2基因臨近，這兩個基因編碼與KARAP/DAP12分子相連的受體，分別表達(dá)于嗜中性粒細(xì)

12、胞和單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。與別的NCRs不同，到目前為止NKp44的同源基因還沒有在與人不同的其它物種發(fā)現(xiàn)。 盡管有關(guān)NK細(xì)胞受體的很多主要問題在最近幾年已經(jīng)得到解決，為了更好的了解NK細(xì)胞的生理功能，還有很多相關(guān)的問題需要解決。一個主要的問題是關(guān)于這些活化受體和協(xié)同活化受體的分子配體的鑒定。應(yīng)用受體特異性的配體來增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，很可能會為腫瘤等疾病的生物治療提供一條新途徑。要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人NCRs等殺傷細(xì)胞

13、受體的相關(guān)配體，需要認(rèn)識NK細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)及其識別特異性，從分子水平了解NK細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮。本課題就是以此為思路，為尋找NKp30的分子配體，我們采用基因工程的一系列實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)人NKp30的基因克隆并成功構(gòu)建了其重組真核表達(dá)載體，為尋找相應(yīng)配體及進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。 二、方法和結(jié)果 1.人NKp30基因克隆及序列分析 根據(jù)GeneBank報(bào)道的人NKp30基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增人NKp30基因的

14、上、下游引物，分別在5端加上限制性酶切位點(diǎn)XhoI和EcoRI。 取正常人新鮮外周血，用本室配置RNA純化試劑盒分離純化細(xì)胞總RNA。以RNA為模板，隨機(jī)六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA第一條鏈。 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用設(shè)計(jì)的NKp30基因上、下游引物和TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增人NKp30基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸

15、桿菌DH5α，接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上。用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析儀進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，克隆的基因和預(yù)期的人NKp30基因序列相差一個堿基但并不影響其表達(dá)，成功構(gòu)建了人NKp30重組質(zhì)粒pMD18-NKp30。 2.人NKp30基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS7細(xì)胞中的表達(dá) 用XhoI和EcoRI分別雙酶切重

16、組載體pMD18-T-NKp30和pIRES2-EGFP，再用1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化，獲得目的基因片段NKp30及線性載體。利用T4DNA連接酶將基因片段NKp30與酶切處理載體pIRES2-EGFP連接，構(gòu)建表達(dá)重組子pIRES2-EGFP-NKp30。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，然后接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上37℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR，初步篩選陽性重組子。挑選陽性克隆，接種于含有100ug/

17、ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液37°C搖床過夜培養(yǎng)。采用樹脂法小量提取質(zhì)粒，然后用XhoI和EcoRI雙酶切鑒定。 取鑒定正確的pIRES2-EGFP/hNKp30，PEG純化法中量提取質(zhì)粒DNA，DU640分光光度計(jì)測定DNA濃度備用。采用體外電穿孔法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48h，熒光顯微鏡下觀察可見到大量綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功，重組質(zhì)粒得到了很好的表達(dá)。抽提細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測可見NKp30mR