HP450基因的克隆及其真核表達(dá)載體pEGFP-HP450的構(gòu)建和表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）從正常大鼠肝組織擴(kuò)增出HP450基因，以pEGFP-N1質(zhì)粒為載體，構(gòu)建pEGFP-HP450真核共表達(dá)載體，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH7919，觀察其表達(dá)，以獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)HP450基因且具有綠色熒光的大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH7919，從而為HP450基因?qū)Ω伟┯绊懙乃幚韺W(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.真核共表達(dá)載體pEGFP-HP450的

2、構(gòu)建：用Trizol試劑從正常大鼠肝組織中提取總RNA，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增HP450基因，并克隆到經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切過(guò)的puc19載體，經(jīng)藍(lán)白篩選及PCR、酶切和測(cè)序鑒定得到陽(yáng)性克隆。再用EcoRI、BamHI內(nèi)切酶將HP450基因從質(zhì)粒上切取、膠回收純化后，與 EcoRI、BamHI雙酶切過(guò)的pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)建的pEGFP-HP450真核共表達(dá)載體經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定。
　　2. pEGF

3、P-HP450轉(zhuǎn)染大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH7919：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，用重組質(zhì)粒pEGFP-HP450轉(zhuǎn)染CBRH7919細(xì)胞，24 h后在熒光倒臵顯微鏡下觀察融合基因的表達(dá)情況。G418篩選出能穩(wěn)定表達(dá)融合基因的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，用RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)HP450基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得HP450目的基因片段（1477）。
　　2．成功構(gòu)建了 puc19-HP450重組載體，

4、HP450基因的測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的一致。
　　3．成功構(gòu)建了 pEGFP-HP450真核共表達(dá)載體，經(jīng) PCR和EcoRI、BamHI雙酶切鑒定其目的片段大小與預(yù)期的一致。
　　4．建立了穩(wěn)定表達(dá) HP450的CBRH7919細(xì)胞系，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光；用RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)HP450基因的表達(dá)，其大小與預(yù)期的一致。
　　結(jié)論：
　　1.本研究成功構(gòu)建了HP4