水貂生長激素基因的克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在細(xì)胞與機體中的表達(dá)研究.pdf

1、水貂是一種具有很高經(jīng)濟價值的毛皮動物，其個體大小與被毛質(zhì)量是決定皮張等級和價格的關(guān)鍵因素。本研究利用基因工程技術(shù)，克隆帶有信號肽序列的水貂生長激素基因，構(gòu)建成真核表達(dá)載體或重組腺病毒，直接注射入水貂體內(nèi)，實現(xiàn)促進水貂生長，增加水貂體長之目的。 在已獲得水貂腦垂體cDNA的基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)報道的水貂生長激素基因序列設(shè)計特異性PCR引物，進行特異性擴增，成功獲得了帶有信號肽序列的780bp水貂生長激素基因。將其克隆到pEasy-T載

2、體上，構(gòu)建成pTmGH克隆載體。 將已獲得的水貂生長激素基因定向插入pVAX1真核表達(dá)載體中，構(gòu)建由CMV啟動子調(diào)控的真核表達(dá)載體pCMVmGH。將從p△EMTCD中獲得的MT啟動子插入pCMVmGH中CMV啟動子下游，構(gòu)建由CMV及MT雙啟動子調(diào)控的表達(dá)載體pCMTmGH。然后用MT啟動子置換pCMVmGH中的CMV啟動子，構(gòu)建由MT啟動子調(diào)控的真核表達(dá)載體pMTmGH。對上述3種真核表達(dá)載體分別進行酶切鑒定和序列測定，證實已

3、成功構(gòu)建了3種含有不同啟動子的水貂生長激素真核表達(dá)載體。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述三種真核表達(dá)載體在BHK細(xì)胞中進行瞬時表達(dá)，結(jié)果表明三種真核表達(dá)載體都可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。 將上述三種真核表達(dá)載體直接注射入2月齡水貂后肢肌肉內(nèi)。每種重組質(zhì)粒分兩個劑量進行注射，即100μg/只、200μg/只。注射后以500mg/kg的ZnSO<,4>隔日進行誘導(dǎo)。實驗期為兩個月，注射前當(dāng)天及注射后第60天分別稱量體重，進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)

4、果表明真核表達(dá)載體pCMTmGH、100μg/只的實驗組與對照組相比體重明顯增加(P<0.05)。 以上結(jié)果表明，將水貂生長激素真核表達(dá)載體直接肌肉注射入水貂體內(nèi)，可以促進水貂的生長發(fā)育，具有重要的理論意義及經(jīng)濟價值。 此外，本文還利用PCR技術(shù)，在已克隆的水貂生長激素基因兩端添加上KpnI酶切位點，然后克隆到pEasy-T載體上，構(gòu)建成pmGH克隆載體。pmGH進行KpnI酶切，回收水貂生長激素基因小片段，與同樣酶切后