HIF-1α基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景：缺氧誘導(dǎo)因子-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)多種靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),紅細(xì)胞生成素(EPO)等的表達(dá),它的活性對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、促進(jìn)血管生成及抑制細(xì)胞凋亡起著重要作用。研究缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響,對(duì)于進(jìn)一步闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,探索腫瘤治療的新靶點(diǎn)有著重要意義。
　　 目的:通過(guò)構(gòu)建HIF-1α-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)研究

2、HIF-1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：從乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中提取HIF-1α mRNA為模版,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,PCR擴(kuò)增HIF-1α目的基因,連接到pMD18-T載體中,測(cè)序驗(yàn)證,雙酶切將HIF-1α轉(zhuǎn)至pcDNA3.1(+)中。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入SK-BR-3細(xì)胞,用Western Blot檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)情況,記錄生長(zhǎng)曲線,結(jié)合Hoechest凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

3、r>　　 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增出的特異片段2749bp,基因測(cè)序結(jié)果與GeneBank報(bào)道的完全一致,表明成功構(gòu)建了HIF-1α-pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體。質(zhì)粒HIF-1α-pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染SK-BR-3細(xì)胞24h后,取出細(xì)胞粘片,置于載玻片上,熒光倒置顯微鏡下觀察估計(jì)其轉(zhuǎn)染效率約為20％。經(jīng)Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組SK-BR-3的HIF-1α的表達(dá)增強(qiáng),連續(xù)9天的細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)