麥長(zhǎng)管蚜嗅覺(jué)相關(guān)蛋白Gqα基因的克隆及真核表達(dá).pdf

1、蚜蟲(chóng)通過(guò)直接取食及傳播病毒病造成危害，是溫帶農(nóng)作物的主要害蟲(chóng)，是農(nóng)業(yè)重大害蟲(chóng)之一。研究表明：昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)在處理來(lái)自環(huán)境的化學(xué)信號(hào)過(guò)程中起著非常重要的作用，從而使昆蟲(chóng)能夠成功地進(jìn)行寄主定位，尋找配偶、產(chǎn)卵場(chǎng)所等。深入了解蚜蟲(chóng)嗅覺(jué)行為，可為研制高效的引誘劑或殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)際意義。 本研究結(jié)合RT-PCR及RACE技術(shù)擴(kuò)增編碼麥長(zhǎng)管蚜嗅覺(jué)相關(guān)Gqα蛋白的cDNA序列，分析該基因的結(jié)構(gòu)特征；并通過(guò)構(gòu)建昆蟲(chóng)桿狀病毒表

2、達(dá)載體對(duì)該基因進(jìn)行真核表達(dá)。取得如下研究結(jié)果： 1.首次克隆麥長(zhǎng)管蚜Gqα全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)已報(bào)道的動(dòng)物嗅覺(jué)相關(guān)蛋白Gqα的氨基酸序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以麥長(zhǎng)管蚜(Sitobionavenae)有翅成蚜cDNA為模板，結(jié)合RT-PCR及RACE技術(shù)擴(kuò)增編碼麥長(zhǎng)管蚜Gqα蛋白的cDNA序列，其cDNA序列開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1062bp，編碼352個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為40.8kDa，與GenBank多個(gè)物種Gqα的cDNA序

3、列及氨基酸序列均有很高相似性(≥82.17％)，并具有Gα亞基q類(lèi)蛋白的典型特征(GenBank核酸序列登錄號(hào)：EF638906，氨基酸序列登陸號(hào)：ABR37295)。 2.利用TOPO及Gateway技術(shù)，通過(guò)重組反應(yīng)，構(gòu)建苜蓿丫紋夜蛾核型多角體桿狀病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV)重組病毒。將N端插入了V5-His6標(biāo)記的V5-His6Gqα列整合

4、到AcMNPV病毒基困組DNA中。得到具有獨(dú)立轉(zhuǎn)染活性的重組桿狀病毒。轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾離體細(xì)胞系Tn(Trichoplusiani)進(jìn)行Gqα蛋白的真核表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)到預(yù)期分子量約42kDa的蛋白帶，Westem-blotting檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物。表明含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽及V5抗原位點(diǎn)的Gqα融合蛋白V5-His6Gqα在昆蟲(chóng)離體細(xì)胞系中成功表達(dá)。 本文為進(jìn)一步研究蚜蟲(chóng)G蛋白的功能及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑奠定了基礎(chǔ)，對(duì)今后深入開(kāi)展昆