掌葉半夏蛋白的基因克隆、表達(dá)及抗蚜活性研究.pdf

1、掌葉半夏(PinelliapedatisectaSchott)是我國傳統(tǒng)的中藥材，掌葉半夏蛋白是其主要藥效成分，常被稱為掌葉半夏凝集素(Pinelliapedatisectaagglutinin,PPA)。掌葉半夏凝集素是一種從掌葉半夏塊莖中分離純化出來的植物蛋白，它是一種能與甘露糖專一性結(jié)合的植物凝集素，具有凝血、抗腫瘤、殺蟲等重要的生理作用。近年來，研究掌葉半夏蛋白對多種害蟲尤其是對同翅目類害蟲的致死作用和掌葉半夏蛋白基因的抗蟲性，

2、已成為植物保護(hù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　以掌葉半夏塊莖為材料，利用RT-PCR克隆技術(shù)成功克隆掌葉半夏蛋白基因(Pinelliapedatisectaagglutinin,PPA)，測序得到PPA序列。PPA開放閱讀框長774bp，編碼的蛋白質(zhì)由257個(gè)氨基酸組成；將所測序列經(jīng)GenBank檢索，發(fā)現(xiàn)PPA與其他甘露糖結(jié)合的植物凝集素基因有較高的同源性，包含3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)。對10種不同植物凝集素氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)分析和遺傳距離分析

3、，發(fā)現(xiàn)掌葉半夏首先與三葉半夏、滴水珠聚成一類；與在天南星科半夏屬的三葉半夏遺傳距離最小，與海芋屬的海芋遺傳遺傳距離最大。
　　根據(jù)已報(bào)道的含有甘露糖結(jié)合位點(diǎn)(MQDDCNL)的凝集素基因序列設(shè)計(jì)帶有雙酶切位點(diǎn)的特異性引物，擴(kuò)增出PPA基因的開放閱讀框，經(jīng)雙酶切后與表達(dá)載體pGEX-6P-3連接，構(gòu)建pGEX-PPA重組表達(dá)載體。通過PCR、雙酶切及測序鑒定。將構(gòu)建好的pGEX-PPA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿埃希氏菌Escherichiaco

4、liBL21(DE3)plysS中，用ITPG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳分析。最后對PPA進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，信號肽、跨膜區(qū)域預(yù)測和亞細(xì)胞定位表明，PPA為分泌蛋白，主要存在于液泡和細(xì)胞基質(zhì)中。PPA存在著1個(gè)可能被糖基化的位點(diǎn)和11個(gè)可能被磷酸化的位點(diǎn)，其空間結(jié)構(gòu)中幾乎不含α-螺旋，存在著大量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，并呈現(xiàn)成簇分布。最后預(yù)測了掌葉半夏蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。
　　用硫酸銨沉淀，透析除鹽，溫差結(jié)晶和聚