甘薯GGPPS基因的克隆分析及抗草甘膦半夏的獲得.pdf

1、萜類化合物(Terpenoids)是植物天然產(chǎn)物中最大的一類化合物，其結(jié)構(gòu)和功能高度多樣化，迄今已有30000多種植物來(lái)源的萜類化合物。植物萜類化合物具有重要的生物學(xué)功能，作為光合色素的類胡蘿卜素是自然界分布最為廣泛的一類色素，總數(shù)達(dá)600多種。不少類胡蘿卜素具有VA原和抗癌活性，因而是人和動(dòng)物食物中不可缺少的成分。 香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPPS)催化15碳的FPP和5碳的IPP縮合生成20碳的GGPP，GGPP作為類胡

2、蘿卜素合成的直接前體，它的合成在類胡蘿卜素的代謝中起著尤為關(guān)鍵的作用。為研究甘薯類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)理和為甘薯類胡蘿卜素代謝工程提供靶點(diǎn)，用RACE技術(shù)從甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)新品種“渝蘇303”中克隆了GGPPS基因全長(zhǎng)cDNA，并且對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)譜分析和功能驗(yàn)證?？寺〉母适鞧GPPS基因(GenBank(R)登錄號(hào)：EU570195；IbGGPPS)cDNA全長(zhǎng)1368b

3、p，其長(zhǎng)度1089bp的開放閱讀框(ORF)編碼長(zhǎng)度為363個(gè)氨基酸殘基的GGPPS蛋白(IbGGPPS)。生物信息學(xué)分析顯示IbGGPPS及其編碼的蛋白與已知GGPPS基因和蛋白序列同源。IbGGPPS序列包含GGPPS蛋白典型的兩個(gè)富含天冬氨酸的域，這兩個(gè)富含天冬氨酸域是和GGPPS活性有重要作用的焦磷酸結(jié)合位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)IbGGPPS定位于質(zhì)體。將IbGGPPS與來(lái)源于被子植物和裸子植物的GGPPSs構(gòu)建分子發(fā)育樹，結(jié)果表明

4、GGPPSs在進(jìn)化樹上分為被子植物和裸子植物兩大類，IbGGPPS隸屬被子植物的一枝。利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)IbGGPPS進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，結(jié)果表明IbGGPPS在薯塊和嫩葉中表達(dá)量最高，在成熟葉片和根中表達(dá)量次之，在莖中則檢測(cè)不到IbGGPPS的表達(dá)。用lbGGPPS的ORF序列替換pTrcAtIPI質(zhì)粒上的擬南芥IPI基因編碼區(qū)，獲得pTrcIbGGPPS質(zhì)粒；在大腸桿菌XLl-Blue中同時(shí)導(dǎo)入pACCAR25ΔcrtE質(zhì)

5、粒和pTrcIbGGPPS質(zhì)粒，構(gòu)建了其β-胡蘿卜素的合成途徑。該菌在顏色互補(bǔ)平板上菌落呈現(xiàn)明亮的橘黃色。結(jié)果表明，IbGGPPS編碼的蛋白具有典型GGPPS的功能。對(duì)IbGGPPS的克隆分析和功能鑒定研究，有助于在分子遺傳學(xué)水平上了解IbGGPPS的功能，并對(duì)研究甘薯類胡蘿卜素前體合成的分子機(jī)理有一定幫助。 轉(zhuǎn)化體篩選方法的研究是植物基因工程中的一個(gè)重要課題，運(yùn)用抗草甘膦基因作為篩選標(biāo)記基因是一種廉價(jià)、安全、高效的篩選方法。草

6、甘膦是目前使用最廣泛的一種非選擇性廣譜除草劑，它是EPSPS酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，阻止莽草酸轉(zhuǎn)為分支酸，抑制芳香族氨基酸的合成。將草甘膦不敏感型：EPSPS酶基因?qū)胫参锖?，可使植物獲得草甘瞵抗性。同時(shí)莽草酸途徑只存在于植物和微生物，抗草甘膦基因?qū)θ梭w是非常安全的。本研究用攜帶植物表達(dá)載體pASM12的根癌農(nóng)桿菌LBA4404對(duì)半夏進(jìn)行葉盤法轉(zhuǎn)化；在選擇培養(yǎng)基中加入10mg/L的草甘膦進(jìn)行篩選，獲得草甘膦抗性的再生植株；對(duì)再生植株進(jìn)行PCR