轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系的創(chuàng)造及利用.pdf

1、雜草是棉花生產(chǎn)主要障礙之一,棉花雜草為害常年造成損失為14％-16％。人工除草是我國(guó)控制草害的傳統(tǒng)方法。隨著城市化進(jìn)程的加速,農(nóng)村人口的轉(zhuǎn)移以及勞動(dòng)力成本的提高,棉田大面積人工除草已不能適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。草甘膦是一種滅生性除草劑,具有廣譜、高效、低毒和無殘留的特點(diǎn),其銷售額占整個(gè)除草劑市場(chǎng)總量的30％,已連續(xù)多年占據(jù)世界農(nóng)藥銷售額首位?？共莞熟⒚藁ㄆ贩N是實(shí)現(xiàn)田間化學(xué)除草的先決條件,培育具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦棉花品種則對(duì)于我

2、國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)具有重要的實(shí)踐意義。本試驗(yàn)以珂字棉201和中棉所49為受體材料,分別通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法兩種方法,轉(zhuǎn)化由本校自主研發(fā)并具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦基因EPSPS-G6,創(chuàng)造抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因棉花種質(zhì)資源,為培育具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花品種提供新的種質(zhì)。同時(shí),對(duì)育成的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)材料進(jìn)行綜合鑒定和評(píng)價(jià),為該種質(zhì)育種利用和抗草甘膦棉花的商業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.轉(zhuǎn)

3、基因抗草甘膦棉花種質(zhì)的創(chuàng)造
　　 本研究以珂字棉201下胚軸作為外植體,用50 mg.L-1卡那霉素作為抗性愈傷組織的篩選劑,將含有玉米泛素Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EPSPS-G6基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入棉花基因組,獲得了2株T0代轉(zhuǎn)基因植株,2株轉(zhuǎn)基因植株開花正常,自交種子種成株行(T1)。經(jīng)過PCR檢測(cè)證實(shí)。EPSPS-G6基因已經(jīng)導(dǎo)入棉花基因組,但對(duì)草甘膦的抗性較差,可能與來源于單子葉玉米的Ubi啟動(dòng)子在棉花中驅(qū)動(dòng)EPSPS-G

4、6基因表達(dá)效率有關(guān)。
　　 通過花粉管通道法將Camv35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EPSPS-G6基因?qū)腙懙孛奁贩N中棉所49,共獲得26個(gè)具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)化植株。PCR檢測(cè)、Southern點(diǎn)雜交、Southem雜交(雙酶切和單酶切)均證實(shí)EPSPS-G6基因已經(jīng)導(dǎo)入棉花基因組。T1田間抗性鑒定結(jié)果表明26個(gè)轉(zhuǎn)化子中20個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)卡方測(cè)定符合一對(duì)基因的分離規(guī)律。經(jīng)T2田間抗性鑒定,共獲得152個(gè)純合材料,分別來源于26個(gè)轉(zhuǎn)化子。

5、>　　 2.田間抗性鑒定
　　 各試驗(yàn)材料分別用15 mM、20 mM、30 mM和40 mM濃度的草甘膦進(jìn)行涂抹鑒定。非轉(zhuǎn)基因的中棉所49和TM-1對(duì)草甘膦十分敏感,15 mM濃度草甘膦處理下死亡。本研究獲得的不同轉(zhuǎn)基因材料對(duì)草甘膦抗性存在著顯著差異,其中采用花粉通管法獲得的26個(gè)轉(zhuǎn)化子在20 mM田間使用草甘膦濃度下均無反應(yīng),但在30 mM草甘膦濃度下,EHC09-045和EHC09-029發(fā)生萎蔫或輕萎蔫,但都得到恢復(fù)。

6、在40 mM草甘膦濃度下,有11個(gè)轉(zhuǎn)化子的幼苗仍無反應(yīng),表現(xiàn)為高抗草甘膦；13個(gè)轉(zhuǎn)化子發(fā)生輕萎蔫或萎蔫,但恢復(fù),表現(xiàn)為中度抗草甘膦；2個(gè)轉(zhuǎn)化子死亡,抗草甘膦性較弱。
　　 3.抗草甘膦性狀的遺傳分析
　　 選用5個(gè)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系(EHC09-002、EHC09-009、EHC09-036、EHC09-038和EHC09-045)進(jìn)行遺傳分析,結(jié)果表明5個(gè)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系均不受細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)的影響,EHC09

7、-002,EHC09-009和EHC09-036三個(gè)轉(zhuǎn)化子與TM-1和中棉所49正反交F2,經(jīng)x檢驗(yàn)符合3∶1的分離規(guī)律,分子檢測(cè)表明這三個(gè)轉(zhuǎn)化子都是單基因插入的,與遺傳研究相符。但EHC09-038和EHC09-045兩個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)x2檢驗(yàn)不符合3:1的分離規(guī)律,這可能與基因的插入位點(diǎn)和基因的整合有關(guān)。
　　 4.轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系的農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)
　　 本研究中通過花粉管通道法獲得的26個(gè)轉(zhuǎn)化子,農(nóng)藝性狀和纖

8、維品質(zhì)總體表現(xiàn)較好,部分轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照。T1農(nóng)藝性狀考察結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花株高、果枝數(shù)和單株鈴數(shù)三項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照相比差異不大,但外源基因的導(dǎo)入對(duì)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的農(nóng)分影響較大。T2農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)考察結(jié)果表明外源基因的導(dǎo)入對(duì)纖維長(zhǎng)度和整齊度影響不大,而對(duì)麥克隆值、伸長(zhǎng)率和斷裂比強(qiáng)度等纖維品質(zhì)指標(biāo),以及鈴重和衣分等農(nóng)藝性狀均有較大影響。因此,轉(zhuǎn)基因棉花育種研究中不僅只注重目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)育,還要注重非目標(biāo)性狀的篩選。
　　

9、 5.市售草甘膦對(duì)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花幼苗生長(zhǎng)的影響
　　 以轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系EHC09-008和EHC09-020及其非轉(zhuǎn)基因遺傳背景親本對(duì)照中棉所49為材料,研究了市售10％草甘膦水劑和95％的草甘膦粉劑對(duì)抗草甘膦棉花種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果表明,10％的草甘膦水劑中可能含有其他除草劑或?qū)γ藁ㄓ酌缟L(zhǎng)發(fā)育有害的物質(zhì),影響抗草甘膦棉種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)。因此,在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花生產(chǎn)應(yīng)用時(shí),應(yīng)必謹(jǐn)慎選用草甘