抗蟲-耐草甘膦融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在轉(zhuǎn)基因煙草中的分析.pdf

1、隨著植物基因工程的發(fā)展，將多個(gè)基因轉(zhuǎn)化植株已成為研究的熱點(diǎn)之一，利用連接肽進(jìn)行多個(gè)基因融合的策略已引起廣泛關(guān)注。以2A和LP4為連接肽表達(dá)的融合基因在植物中表達(dá)時(shí)會(huì)發(fā)生剪切，將兩個(gè)基因分開。本論文利用連接多肽2A和LP4/2A分別與抗蟲新基因Bt crylAh和編碼EPSP合酶的耐草甘膦基因mG<,2>連接起來構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，既可以達(dá)到兩個(gè)基因的融合，又可以通過剪切形成兩個(gè)蛋白分別行使功能。 為了比較連接肽2A和LP4/2

2、A的剪切效率，以及不同基因與連接肽連接位置差異對(duì)基因表達(dá)的影響，利用重疊PCR及DNA克隆技術(shù)共構(gòu)建了四個(gè)融合基因表達(dá)載體：pHAG、pHLAG、pGAH、pGLAH。其中pHAG、pill,AG為crylAh基因在前，mG<,2>基因在后，前者以2A為連接肽，后者以LP4/2A為連接肽；pGAH、pGlJAH為mG<,2>基因在前，crylAh基因在后，前者以2A為連接肽，后者以LP4/2A為連接肽。同時(shí)構(gòu)建了兩個(gè)單基因載體pSAh、

3、pSmG<,2>作為對(duì)照，比較兩基因在不同載體中表達(dá)量的異同。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中，得到再生植株529株，經(jīng)GUS組織化學(xué)分析，其中有261株再生苗為陽性植株，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.3％；對(duì)GUS檢測(cè)結(jié)果陽性的植株，分別利用crylAh，mG<,2>基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明目的基因整合到了煙草的基因組中；RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化的外源融合基因在煙草體內(nèi)正確轉(zhuǎn)錄，融合基因在轉(zhuǎn)錄水平上沒有發(fā)生剪切；

4、Western Blot結(jié)果表明crylAh基因和mG<,2>基因在植物體內(nèi)正確翻譯并且完全剪切；ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)融合基因表達(dá)載體pGLAH煙草中mG<,2>蛋白的表達(dá)量達(dá)到轉(zhuǎn)基因煙草葉片可溶性總蛋白的0.33％，明顯高于對(duì)照載體及其它融合基因表達(dá)載體，而crylAh在各載體中的表達(dá)量都在0.2％以上。 將獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了生物活性測(cè)定?？瓜x性生測(cè)為棉鈴蟲初孵幼蟲，結(jié)果表明轉(zhuǎn)融合基因表達(dá)載體植株對(duì)棉鈴蟲的校正死亡率均在90％

5、以上；草甘膦耐受性檢測(cè)選用濃度為3‰的草甘膦噴灑T<,0>代植株葉片，融合基因表達(dá)載體pGLAH表現(xiàn)出良好的抗性，存活率為100％，還對(duì)T<,1>代轉(zhuǎn)基因煙草種子在含有草甘膦培養(yǎng)基上的出芽及生長(zhǎng)情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)融合基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株具有草甘膦耐受性，其中轉(zhuǎn)融合基因表達(dá)載體pGLAH的煙草種子可以在5mM的草甘膦培養(yǎng)基中正常發(fā)芽、生長(zhǎng)，高耐植株占檢測(cè)植株的87.5％。相對(duì)于單價(jià)基因表達(dá)載體，融合基因表達(dá)載體表現(xiàn)出較高的抗蟲