抗草甘膦真菌的分離及EPSPS基因克隆與表達(dá)研究.pdf

1、草甘膦是一種高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸的非選擇性滅生除草劑。它于1974年在美國(guó)被注冊(cè)登記，是全世界除草劑消費(fèi)量最大的品種之一。草甘膦能防除絕大多數(shù)一年生及多年生雜草，但由于其非選擇性，在殺死雜草的同時(shí)對(duì)農(nóng)作物也具有毒害作用。而提高作物對(duì)草甘膦的抗性，有利于草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用并降低生產(chǎn)成本。因此，抗除草劑基因的發(fā)掘與利用已成為當(dāng)今生物基因工程領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。
　　 從抗除草劑微生物中分離抗性基因是最主要的途徑。從受除草劑極端污

2、染的土壤中篩選抗除草劑菌株是一種有效的方法。本研究從生產(chǎn)草甘膦工廠排污口的污泥中篩選到一株高抗草甘膦的真菌，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特性測(cè)定及18S rRNA分子鑒定。利用SMARTer技術(shù)構(gòu)建了菌株的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。以抗草甘膦菌株假絲酵母菌TY-JM(Candidapalmioleophila)和黃曲霉TZ1985(Aspergillus flavus)為材料，首次從假絲酵母與黃曲霉中分離得到EPSPS基因，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿

3、菌驗(yàn)證其具有抗草甘膦功能，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。期望能為轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物新品種的培育提供新的基因資源。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用瓶培養(yǎng)富集技術(shù)，從生產(chǎn)草甘膦工廠排污口的污泥中篩選到一株抗草甘膦濃度高達(dá)900mmol/L的真菌，命名為T(mén)Y-JM。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性及18S rRNA序列分析，TY-JM被鑒定為假絲酵母菌Candida palmioleophila。形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性與前人研究結(jié)果

4、一致，18S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析表明其與假絲酵母同源性高達(dá)99％，序列上傳至GenBank登錄號(hào)為JN656713。
　　 2.以菌株TY-JM總RNA為模板，利用Clontech公司CreatorTM SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit構(gòu)建了TY-JM的cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行了鑒定。原始文庫(kù)滴度為2.58×106 cfu/ml，文庫(kù)庫(kù)容為2.58×106 cfu，擴(kuò)增后滴度為3.

5、42×109 cfu/ml，重組率97.6‰文庫(kù)插入片段范圍為500 bp～3 kb，主要集中在1 kb附近，說(shuō)明該文庫(kù)cDNA片段的序列比較完整，文庫(kù)質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3.通過(guò)比較基因組學(xué)的方法，分離得到了假絲酵母TY-JM和黃曲霉TZ1985的EPSPS蛋白編碼序列。編碼序列長(zhǎng)度分別為1311 bp和1353 bp，分別編碼436個(gè)氨基酸和450個(gè)氨基酸，理論分子量分別為46 kDa和48 kDa，等電點(diǎn)分別為5.77和

6、6.04。TY-EPSPS(TY-JM的EPSPS)和TZ-EPSPS(TZ1985的EPSPS)基因推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)NCBI Protein BLAST程序分析表明，TY-EPSPS基因與熱帶假絲酵母、杜氏假絲酵母和白假絲酵母等具有80%的序列一致性；與核盤(pán)菌、棒曲霉具有66%的序列一致性，TZ-EPSPS基因與煙曲霉、棒曲霉、黑曲霉、白曲霉和土曲霉具有90%的序列一致性；與杜氏假絲酵母、白假絲酵母和熱帶假絲酵母具有68%的序列一致

7、性。采用MEGA4.0軟件分析TY-EPSPS和TZ-EPSPS基因與其它種的EPSPS的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，TY-EPSPS和TZ-EPSPS均與真菌的EPSPS親緣關(guān)系較近，而與植物和細(xì)菌的EPSPS親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中TY-EPSPS與酵母屬親緣關(guān)系最近，TZ-EPSPS與曲霉屬的親緣關(guān)系最近。
　　 4.將TY-EPSPS和TZ-EPSPS連接pET-30a載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，使大腸桿菌對(duì)草甘膦的抗性從