苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、Ⅰ型核糖體失活蛋白MAP30，是從苦瓜種子和果實(shí)中分離純化的一種HIV病毒抑制劑，具有抗病毒、抗腫瘤和抗菌作用。 本文根據(jù)已發(fā)表的MAP30基因的序列比對結(jié)果，采用PCR法從精選白皮苦瓜(JX)、穗農(nóng)早優(yōu)苦瓜(ZY)、碧翠苦瓜(BC)、銀田長白苦瓜(YT)和銀田藍(lán)山大白苦瓜(LAN)5個品種中克隆得到5個長度均為861bp的MAP30基因，即JX-MAP30、ZY-MAP30、LAN-MAP30、BC-MAP30(Geneban

2、k accession No：DQ643967)和YT-MAP30(DQ643968)，其中除BC-MAP30和YT-MAP30基因與已報(bào)道的MAP30基因(AJ294541)不同，存在變異位點(diǎn)外，其余均相同。 因此，本研究重點(diǎn)對BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸以及推測的氨基酸序列進(jìn)行了分析，并利用生物信息學(xué)方法對其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)作了預(yù)測。此外，還對YT-MAP30基因的完整編碼區(qū)(YT<,f>)和成熟蛋白編碼區(qū)(YT

3、<,m>)片段同時(shí)進(jìn)行了原核表達(dá)工程菌的構(gòu)建、表達(dá)條件的優(yōu)化以及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測、可溶性分析和蛋白質(zhì)雜交分析等研究工作。其主要結(jié)果如下： 1．序列分析表明，BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸序列與已報(bào)道的MAP30基因分別存在2個和3個堿基的不同，但均編碼263個氨基酸殘基組成的成熟蛋白。 2．BC-MAP30和YT-MAP30基因的推導(dǎo)氨基酸序列與其他葫蘆科植物的Ⅰ型核糖體失活蛋白以及天花粉毒蛋白

4、、多花白樹毒蛋白、肥皂草毒素蛋白的氨基酸序列同源性分別為68.90％、82.75％、71.25％和66.45％，且其第90～220位氨基酸序列較為保守。利用生物信息學(xué)進(jìn)行的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，在：BC-MAP30和YT-MAP30蛋白的整個二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲含量最高，其次是α-螺旋和β-折疊。信號肽區(qū)富含α-螺旋和無規(guī)則卷曲；N-端區(qū)富含β-折疊和無規(guī)則卷曲；高度螺旋區(qū)富含α-螺旋；C-端則富含無規(guī)則卷曲。 3．DNA測序結(jié)果

5、表明，在重組表達(dá)質(zhì)粒中，YT<,f>-MAP30和YT<,m>-MAP30的序列和插入位點(diǎn)正確。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，pET-YT<,m>/MAP30-BL21 工程菌在30℃、1mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h后，在35kD處出現(xiàn)一條增加的表達(dá)蛋白條帶，且以可溶形式表達(dá)。 4．蛋白質(zhì)分子雜交表明，重組蛋白對鼠抗：His-tag多克隆抗體具有特異抗性。 5．pET-YT<,f>/MAP30-BL21工程菌經(jīng)不同誘導(dǎo)時(shí)間、誘