三葉半夏與掌葉半夏凝集素原核表達(dá)及特性研究.pdf

1、三葉半夏(Pinelli.ternate)和掌葉半夏(Pinelli.pedatisecta)都屬天南星科半夏屬植物。半夏是傳統(tǒng)中藥材，在800多種常用中藥中使用頻率排名第22位，在我國(guó)已經(jīng)有2000多年的藥用歷史。主要活性成分除活性多糖、生物堿、甾醇外，還有蛋白質(zhì)。其中，凝集素是半夏總蛋白的重要組分之一。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的三葉半夏和掌葉半夏的凝集素屬于單子葉植物中甘露糖凝集素家族。三葉半夏和掌葉半夏在形態(tài)上十分相似，同時(shí)也含有相似的化學(xué)成分，

2、但是在中國(guó)傳統(tǒng)的中藥處方中，三葉半夏主要用來(lái)鎮(zhèn)吐、止咳、祛痰、抗早孕等，而掌葉半夏除了鎮(zhèn)吐、止咳、祛痰外，在抗腫瘤方面療效更加明顯。半夏作為傳統(tǒng)中藥其藥用價(jià)值已被公認(rèn)，但其抗嘔，抗早孕、抗腫瘤等機(jī)制及其有效組分仍不清楚。同時(shí)，由于連年栽培導(dǎo)致各種病毒和病蟲害的侵染，半夏種質(zhì)日益退化，產(chǎn)量逐年遞減，市場(chǎng)缺口逐年擴(kuò)大。
　　 本研究將三葉半夏凝集素(PTA)和掌葉半夏凝集素(PPA)基因ORF克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)上，成

3、功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定以及測(cè)序分析顯示為正確重組。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，裂解菌液作SDS-PAGE分析，在28kDa處有一條信號(hào)特別的條帶，與預(yù)期相符，顯示表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的70％左右，且融合蛋白以不溶性的包涵體形式存在。超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌，對(duì)包涵體進(jìn)行溶解和梯度透析復(fù)性；復(fù)性后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白純度較高，可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步探討半夏凝集素亞基

4、之間的相互作用及凝集活性的差異，用同樣的方法成功構(gòu)建半夏凝集素亞基原核表達(dá)質(zhì)粒，半夏凝集素亞基同樣以包涵體的形式存在，包涵體經(jīng)過(guò)梯度透析后純度較高，直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 三葉半夏和掌葉半夏凝集素及其亞基對(duì)兔血紅細(xì)胞的凝集試驗(yàn)表明，掌葉半夏凝集素的凝集活力為三葉半夏凝集素的4倍，凝集素第三個(gè)活性位點(diǎn)兩個(gè)氨基酸的差異可能是引起三葉半夏和掌葉半夏凝集素凝集活性不同甚至藥理作用不同的主要原因。原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的凝集素亞基不能凝集兔血