工程菌表達(dá)可溶性半夏凝集素及其活性研究.pdf

1、半夏凝集素（Pinelliaternataagglutinin，PTA）是從傳統(tǒng)中藥半夏塊莖中分離得到的一種活性物質(zhì)，在分類上屬于單子植物甘露聚糖結(jié)合凝集素，可以凝集兔血細(xì)胞、鼠血細(xì)胞，但不能凝集人血細(xì)胞，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等都有比較好的抑制效果，是一類發(fā)展前景較好的的潛在抗腫瘤活性成分。而從天然半夏凝集素受半夏塊莖的產(chǎn)量限制，且有周期性，限制了以后大規(guī)模的開發(fā)和應(yīng)用。故部分研究者選擇工程菌表達(dá)半夏凝集素，以期獲得與天

2、然半夏凝集素功能相近的表達(dá)產(chǎn)物。在以往的凝集素表達(dá)研究中，課題組選用了原核表達(dá)系統(tǒng)以及家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了半夏凝集素，但仍存在表達(dá)產(chǎn)物為包涵體、純化不易、表達(dá)周期過(guò)長(zhǎng)、不適宜工業(yè)化生產(chǎn)等問題。本研究首次采用人源SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了可溶的三葉半夏凝集素C端結(jié)構(gòu)域(P-D2)以及首次采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了可溶的三葉半夏凝集素N端結(jié)構(gòu)域(P-D1)。
　　本研究分別構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32-SUMO-P

3、-D2以及真核穿梭質(zhì)粒pPIC9k-P-D1，分別地轉(zhuǎn)入到原核表達(dá)菌株BL21(DE3)以及酵母表達(dá)菌株SMD1168并成功地篩選到了陽(yáng)性的表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG以及甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)出帶有His標(biāo)簽的可溶的SUMO-P-D2蛋白（His標(biāo)簽在SUMO蛋白N端，P-D2蛋白上無(wú)His標(biāo)簽）以及P-D1蛋白。其中SUMO-P-D2蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后重新鎳柱上樣獲得純度超過(guò)95％的P-D2蛋白，產(chǎn)量在5mg/L左右，P-D2蛋白經(jīng)鎳

4、柱純化同樣可獲得，產(chǎn)量在12mg/L左右。
　　凝血實(shí)驗(yàn)選用小鼠紅細(xì)胞，天然半夏凝集素在4μg/mL時(shí)可以觀察到較好的凝血現(xiàn)象。當(dāng)P-D1以及P-D2的濃度為6μg/mL時(shí)，才可以觀察到較好的凝血現(xiàn)象。天然半夏凝集素、P-D1以及P-D2蛋白都可以和D-甘露聚糖發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，最低抑制濃度分別為0.56mM±0.05、0.67mM±0.12以及0.63mM±0.05，而不能和D-乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖發(fā)生反應(yīng)?？拐婢鷮?shí)驗(yàn)顯示，

5、P-D1蛋白同天然半夏凝集一樣對(duì)細(xì)交鏈孢菌有比較好的抑制效果。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)顯示P-D1以及PTA對(duì)所選用的腫瘤細(xì)胞系（肝癌Bel-7404、結(jié)腸癌SW-620、肝癌SMMC-7721）都有比較好的抑制其增殖活性。Bel-7404肝癌細(xì)胞的24h以及48h的MTT實(shí)驗(yàn)顯示，P-D1以及PTA蛋白對(duì)Bel-7404細(xì)胞作用效果呈現(xiàn)出濃度依賴以及時(shí)間依賴特點(diǎn)。P-D1蛋白對(duì)SW-620也有良好的抑制效果且為濃度依賴，但對(duì)同樣是肝癌SMM

6、C7721抑制不是濃度依賴，且抑制效果不如對(duì)其他兩種細(xì)胞系的抑制效果。P-D2對(duì)Bel-7404以及SW-620這兩種細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的抑制其增殖的效果。其中P-D2蛋白對(duì)肝癌Bel-7404的抑制效果明顯優(yōu)于對(duì)結(jié)腸癌SW-620的抑制效果(p＜0.05)。P-D1蛋白以及P-D2蛋白抑制相同的癌細(xì)胞的效果沒有明顯的差異(P＞0.05)。在Hoechst染色觀察凋亡觀察實(shí)驗(yàn)中，可以明顯地觀察到這三種凝集素蛋白引起的凋亡現(xiàn)象，其中濃度高的