蓖麻毒素B鏈可溶性表達及其工藝優(yōu)化、純化.pdf

1、目的:通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，優(yōu)化誘導表達條件，實現(xiàn)重組蓖麻毒素B鏈蛋白的大量可溶性表達，并提高其純度。目的是用重組蛋白作為抗原，為制備抗體以及蓖麻毒素疫苗的研究提供前期技術支持和理論基礎。
　　方法:本實驗首先通過PCR擴增出目的基因RTB連接于pMD-18T克隆載體，經(jīng)序列比對正確后，將目的基因插入到表達載體P300-TrxA-Sumo和pGEX-4T-1中，構建重組表達質(zhì)粒P300-TrxA-Sumo-RTB及pGEX-4

2、T-1-RTB。將鑒定構建成功的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，建立表達工程菌 P300-TrxA-Sumo-RTB/BL21、pGEX-4T-1-RTB/BL21。通過IPTG的誘導，利用單因素試驗和正交試驗法在不同誘導時間、不同IPTG濃度以及不同溫度的情況下對表達條件進行優(yōu)化，實現(xiàn)對RTB的可溶性表達。通過Ni-Chelating Sepharose親和層析柱純化得到純度相對較高的重組蛋白，最后切去Sumo標簽，

3、得到目的蛋白RTB。并通過Western blot和間接ELISA法證明其具有良好的免疫原性。檢測RTB作用于RAW264.7細胞的一氧化氮水平。最后用MTT法檢測RTB作用于小鼠巨噬細胞時存活情況。
　　結果:成功構建重組表達質(zhì)粒P300-Trxa-Sumo-RTB以及pGEX-4T-1-RTB。在經(jīng)過誘導條件的優(yōu)化后，成功實現(xiàn)重組蓖麻毒素蛋白的大量可溶性表達，表達量分別為11％和8％。通過親和層析柱純化得到純度相對較高的目的蛋

4、白。經(jīng)過Western blot和ELISA驗證目的蛋白具有免疫原性。一氧化氮檢測結果顯示，RTB組數(shù)值較正常細胞組增高，說明RTB能夠促進NO的釋放，可能作為治療巨噬細胞相關炎癥性疾病的突破口。通過MTT法證明純化得到的RTB對于小鼠巨噬細胞RAW264.7不具有毒性。
　　結論:經(jīng)大腸桿菌誘導條件工藝優(yōu)化后，可實現(xiàn)重組蓖麻毒素B鏈蛋白可溶性表達。經(jīng)Ni-NTA、GST標簽親和層析柱純化后獲得具有生物學活性的蛋白，且重組蛋白具有