腸三葉因子在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及腸三葉因子受體的初步研究.pdf

1、背景： 腸三葉因子(intestinaltrefoilfactor，：ITF)是由腸道杯狀細(xì)胞特異分泌的具有特殊空間結(jié)構(gòu)的小分子多肽[1]，ITF不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖和移行，還由于其空間結(jié)構(gòu)中有和粘蛋白的寡聚糖或多糖側(cè)鏈結(jié)合的位點(diǎn)，使之形成穩(wěn)定的凝膠復(fù)合物，穩(wěn)定腸粘液層。此外，ITF具有蛋白酶水解抗性和酸堿穩(wěn)定性，可減輕多種致傷因子造成的消化道損害，這些特性決定了ITF在腸道的自我保護(hù)機(jī)制中占重要地位。目前對(duì)ITF的研究已很深入，

2、但有關(guān)ITF受體的研究相對(duì)滯后，ITF是否具有獨(dú)特的受體存在爭(zhēng)議，一些學(xué)者認(rèn)為ITF沒有特異受體，它依賴表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[2]；另一些學(xué)者則持不同觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)了一類能和ITF特異結(jié)合的蛋白，將其稱之為ITF結(jié)合蛋白，并對(duì)蛋白的基本特性進(jìn)行了初步分析[3]，但這些蛋白是否就是ITF受體還缺乏具有說服力的直接證據(jù)。 目的： 在成功獲取重組表達(dá).ITF的基礎(chǔ)上，通過配體受體動(dòng)力學(xué)研究和受體定位研究，

3、探索在腸上皮細(xì)胞上是否存在ITF特異受體，以及受體在細(xì)胞上的分布特點(diǎn)。 方法： 1.ITF在酵母中的表達(dá)和純化：將成功轉(zhuǎn)化的含ITF成熟肽序列的酵母X-33菌株進(jìn)行Zeocin篩選，將陽性轉(zhuǎn)化子接種于YPD液體培養(yǎng)基中搖瓶表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物上清經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、Ni-NTA親和層析、超濾離心三步純化以獲取重組表達(dá)的ITF。TricineSDS-PAGE及Westernbloting鑒定重組蛋白。 2.腸三葉因子受體放

4、射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Radioligandbindingassay，RLBA)：摸索ITF受體放射性配基結(jié)合分析的最佳反應(yīng)溫度、時(shí)間、細(xì)胞濃度和非標(biāo)記ITF的濃度。在此條件下在IEC-6細(xì)胞上進(jìn)行ITF受體放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)，得到親和常數(shù)(KD)及最大結(jié)合容量(Bmax)。在相同的條件下對(duì)HT-29、5E6L、HaCat細(xì)胞上ITF受體進(jìn)行分析，比較不同細(xì)胞上：ITF受體的差異。通過大量：EGF、ITF及EGFR阻斷肽對(duì)ITF受體和EGF

5、受體競(jìng)爭(zhēng)抑制，證實(shí)ITF特異受體的存在。 3.腸三葉因子受體在腸上皮細(xì)胞上的定位：將傳代培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞用0.5％的胰酶消化后，細(xì)胞濃度調(diào)為約2.5×105個(gè)/ml，加入放有8×8mm蓋玻片的24孔板于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育，待IEC-6腸上皮細(xì)胞貼壁，細(xì)胞爬片用PBS清洗3遍后與B-藻紅蛋白(B-PE)標(biāo)記的ITF(BPE-ITF)在4℃下分別共同孵育0.5，1.0，2.0，4.0h，孵育結(jié)束后PBS清洗3遍×3mi

6、n，細(xì)胞片置于載玻片上并用90％緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察ITF受體在IEC-6細(xì)胞上的分布規(guī)律。并使用過量的EGF、ITF和EGFR阻斷肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，觀察熒光的變化情況。 結(jié)果： 1.酵母表達(dá)獲得ITF，產(chǎn)物經(jīng)TricineSDS-PAGE、Westernblot鑒定具有良好的抗原性和特異性，三步純化后重組蛋白的純度超過95％，表達(dá)量達(dá)到約50mg/L。 2.放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)最佳反應(yīng)條件為4℃

7、，孵育30min，細(xì)胞濃度為5.0×105個(gè)/ml，非特異結(jié)合配基濃度為標(biāo)記配基的10000倍。在此條件下，對(duì)：IEC-6、HT-29、5E6L和HaCat細(xì)胞上ITF受體進(jìn)行放射性結(jié)合分析，并通過Scatchard線性回歸分析得到IEC-6細(xì)胞最大結(jié)合容量Bmax=62.713×106結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞，親和常數(shù)KD=4.3478×10-10mol/L；HT-29細(xì)胞最大結(jié)合容量Bmax=61.1583×106結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞，親和常數(shù)KD

8、=0.8849×10-10mol/L；5E6L細(xì)胞最大結(jié)合容量Bmax=184.89×106結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞，親和常數(shù)KD=3.448×10-10mol/L。根據(jù)所得到的KD值和Bmax分析，ITF與IEC-6、HT-29、5E6L細(xì)胞結(jié)合呈高親和力，但受體密度有所差異。表皮細(xì)胞HaCat與ITF結(jié)合呈低親和力。EGF對(duì)ITF受體及：ITF對(duì)EGF受體均無競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，EGFR阻斷肽對(duì)ITF與IEC-6細(xì)胞的結(jié)合并未受影響。 3.

9、激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記的ITF首先聚集在細(xì)胞膜上，隨時(shí)間和濃度的增加，熒光標(biāo)記的ITF逐漸向胞漿與胞核轉(zhuǎn)移。過量的ITF可明顯抑制熒光標(biāo)記的ITF與細(xì)胞結(jié)合，熒光強(qiáng)度明顯降低。EGF和EGFR阻斷肽對(duì)，ITF在細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度和向胞漿、胞核的轉(zhuǎn)移沒有影響。 結(jié)論： 1.重組表達(dá)的ITF產(chǎn)量約50mg/L，純度＞95％，符合受體研究中對(duì)配體的要求。 2.確定了放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)最佳反應(yīng)條件，并證明腸上皮細(xì)胞