腸三葉因子受體的分離、鑒定及其生物信息學分析.pdf

1、背景:腸三葉因子(intestinal trefoil factor,ITF或TFF3)是含有59個氨基酸殘基的單鏈多肽[1],分子量為6.7kD,分子中含有1個三葉結構,其核心的38～39個氨基酸殘基中包含6個半胱氨酸,形成3對鏈內(nèi)二硫鍵,兩兩相接產(chǎn)生特征性三葉結構,并因此而得名。研究表明,ITF是具有潛在藥用價值的小分子多肽,能減輕各種致傷因素導致的粘膜損傷,促進腸上皮細胞增殖、移行,從而啟動受損腸粘膜修復,促進粘膜屏障重建[2-4

2、]。但ITF作用機制迄今尚不清楚,雖然觀察到ITF與多條信號通路有關,但都不能完整地描繪出其作用信號網(wǎng)絡。一些學者推測ITF可能通過自身受體(ITFreceptor,ITFR.)來傳導信號,介導細胞的增殖和移行。本課題組前期進行了ITF受體配體放射性結合分析、動力學研究,明確:ITF受體與配體結合相關參數(shù)及受體密度等數(shù)據(jù),提出腸上皮細胞膜上存在特異ITF受體(ITFR)的觀點。但ITFR是已知還是未知蛋白,其理化性質(zhì)和功能均不清楚。

3、r>　　 目的:通過重組表達含有生物標簽的hITF融合蛋白,利用pull-down技術釣取ITFR,并采用質(zhì)譜分析、生物信息學分析及酵母雙雜交等方法對獲取的蛋白進行綜合分析,以確定該蛋白是否為ITFR。
　　 方法:
　　 1.制備用于受體研究的重組hITF融合蛋白
　　 (1)hITF在畢赤母酵母菌中的表達和純化:采用本課題組保存的酵母菌X-33(含pGAPZaA-hITF),組成性表達hITF,表達上清經(jīng)硫

4、酸銨分級沉淀,Ni+-NTA親和層析,超濾純化三步法進行純化濃縮,純化后產(chǎn)物Western blot鑒定。
　　 (2)hITF融合蛋白在大腸桿菌中的表達和純化:通過PCR獲取ITF成熟肽cDNA基因片段,克隆至質(zhì)粒pGEX-4T-1獲得重組載體;雙酶切鑒定后轉化至EcoliBL21(DE3)進行誘導表達,優(yōu)化表達條件獲得最大表達產(chǎn)量;GST瓊脂糖凝膠親和層析、超濾離心純化重組蛋白。SDS-PAGE蛋白電泳、Western bl

5、ot和質(zhì)譜鑒定ITF重組蛋白。
　　 2.ITFR的分離與生物信息學分析:以重組表達的帶有生物標簽的hITF蛋白為誘餌,將其固化到親和層析凝膠上,與腸上皮細胞膜蛋白作用,利用受體配體間的相互作用,釣取受體蛋白,緩沖液沈脫,SDS-PAGE凝膠電泳分離,切膠酶解,質(zhì)譜分析捕獲的蛋白,并以免疫共沉淀予以驗證。利用生物信息學軟件和文獻檢索軟件,分析所獲取蛋白的一般理化性質(zhì)、可能的跨膜區(qū)域、總疏水性、蛋白質(zhì)GO注釋,并以腸道、ITF及受

6、體為關鍵詞進行文獻檢索,將所獲得的數(shù)據(jù)進行綜合分析。
　　 3.酵母雙雜交驗證ITF相互作用蛋白:分別構建誘餌質(zhì)粒和人結腸癌細胞HT-29cDNA文庫,提取質(zhì)粒,共轉化至酵母菌Mav203;營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選陽性克隆,鑒定陽性克隆后測序;應用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具對測序結果進行序列比對,分析是何種蛋白的基因序列。
　　 結果:
　　 1.hITF表達成功,獲得純度較高的重組hITF蛋白。
　　 (

7、1)hITF在酵母菌X-33中組成性表達成功,表達產(chǎn)量約為50mg/L,經(jīng)硫酸銨分級沉淀、Ni+-NTA親和層析、超濾離心后獲得純度95％以上的重組hITF蛋白。
　　 (2)獲得正確的hITF成熟肽cDNA序列,成功構建含目的基因的重組載體pGEX-4T-1-hITF;在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進行表達,表達產(chǎn)物主要集中在細菌胞質(zhì)中。重組hITF融合蛋白產(chǎn)量約120mg/L。Western blot和質(zhì)譜分析

8、證明重組蛋白具有良好的抗原性和特異性且蛋白序列正確;通過GST瓊脂糖凝膠親和層析、超濾離心后重組蛋白的純度達95％以上。
　　 2.以含His標簽的重組hITF融合蛋白為誘餌,利用pull-down技術獲得了一個分子量約為35kD的特異性條帶,以含有GST標簽的重組hITF融合蛋白為誘餌蛋白的pull-down實驗和免疫共沉淀實驗同樣證實該35kD蛋白的存在。對質(zhì)譜分析所獲得95個候選蛋白利用生物信息學手段分析蛋白的分子量、等電

9、點、不穩(wěn)定系數(shù)、疏水性、蛋白分布、跨膜域預測和GO注釋,依據(jù)分子量大小、蛋白質(zhì)分布和可能的跨膜域GO注釋結果得到3個ITFR候選蛋白:PDZD2、Wnt8b、ITIH4,文獻檢索其與腸道、ITF及受體相關的文章分別為15篇、17篇、23篇。
　　 3.成功構建誘餌質(zhì)粒和人結腸癌細胞HT-29cDNA文庫,質(zhì)粒共轉化至酵母菌Mav203,篩選陽性克隆進行鑒定并測序,比對分析后共篩選出4個ITF相互作用蛋白:PDZD2、TIMP1、

10、CD44 antigen和VPS4-1。
　　 結論:
　　 1.制備了用于ITF受體研究的重組hITF融合蛋白。
　　 2.使用pull-down技術獲得了一個分子量約為35kD的特異性條帶并做質(zhì)譜分析,對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行生物信息學分析,初步判定PDZD2、Wnt8b、ITIH4為ITFR候選蛋白。
　　 3.酵母雙雜交獲取4個ITF相互作用蛋白.PDZD2、TIMP1、CD44 antigen和VPS4-