胎兒與成人心肌中l(wèi)ncRNA的差異表達及其生物信息學分析.pdf

1、目的:
　　胎兒心臟約在妊娠10周時已經成型，在之后的心臟發(fā)育過程中，胎兒心肌在能量代謝、心肌纖維排列和心肌細胞增殖能力等方面發(fā)生很大變化。研究已經發(fā)現(xiàn)lncRNA參與多種器官的發(fā)育過程，因此，我們推測lncRNA的表達可能會影響心臟的發(fā)育過程。本課題組擬通過lncRNA芯片分析13-17周胎兒心肌和30-40歲成年人心肌組織的差異lncRNAs和mRNAs表達，通過生物信息學分析差異lncRNAs的生物學功能，為探討lncRNA

2、s在心臟發(fā)育中的作用機制奠定基礎。
　　方法:
　　1.收集6例13-17周胎兒心臟和6例30-40歲成年人心臟，取各例部分組織做HE染色觀察胎兒和成人心肌纖維排列情況;Masson染色觀察膠原含量情況;免疫熒光染色觀察胎兒和成人心臟的心肌細胞增殖情況。提取各例左心室組織總RNA。
　　2.通過lncRNA芯片，檢測胎兒和成人心臟組織的lncRNA和mRNA表達譜，以胎兒組和成人組差異倍數(shù)大于或等于2、P值小于或等于0

3、.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于或等于0.05為標準，篩選出胎兒組和成人組存在的差異表達lncRNAs和mRNAs。
　　3.對差異表達mRNAs進行顯著性功能分析(GO Analysis)和顯著性信號通路分析(Pathway Analysis)，得到胎兒與成人心肌差異表達mRNAs所參與的顯著性功能和信號通路。
　　4.建立差異lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，利用皮爾遜相關系數(shù)預測差異表達lncRNAs的靶基因，以皮爾遜

4、相關系數(shù)絕對值大于或等于0.9998和P值小于0.001為標準，找到差異表達lncRNA可能的靶基因;分析差異表達lncRNA與mRNA的基因位置關系，利用cis分析差異表達lncRNAs可能相關的靶基因;對差異lncRNAs的預測靶基因進行顯著性功能分析，得到差異基因所參與的顯著性、靶向性功能;對差異lncRNAs的靶基因進行顯著性信號通路分析，得到差異基因所參與的顯著性信號通路。
　　5.利用BLAST對差異倍數(shù)大于10倍的l

5、ncRNA進行人與小鼠間的序列比對。
　　6.實時熒光定量PCR技術驗證差異表達的lncRNAs:選取具有代表性的差異表達的lncRNAs，采用熒光定量PCR技術驗證其在胎兒組和成人組的差異表達。
　　結果:
　　1.HE染色顯示成人心肌纖維排列較胎兒心肌纖維更整齊有序，成人心肌纖維為長條形，而胎兒心肌纖維為多角形;Masson染色顯示成人心肌有更高的膠原含量;免疫熒光染色結果顯示13-17周胎兒心肌可見的明顯的增殖心

6、肌細胞，而成人心肌中無心肌細胞增殖。
　　2.lncRNA芯片分析結果顯示，胎兒組和成人組存在5738個差異表達的lncRNAs，其中2538個在成人組發(fā)生下調，3200個發(fā)生下調。差異表達的mRNA有5547個，其中在成人組下調的有3220個，上調的有2327個。
　　3.對差異表達mRNAs進行顯著性功能分析和顯著性信號通路分析，結果顯示成人組下調mRNAs參與52個顯著性功能類別和20個信號通路，主要與細胞周期相關;成

7、人組上調mRNAs參與23個功能類別和10個信號通路，主要與抗原性及離子通道相關。
　　4.對差異表達的lncRNAs和差異表達的mRNAs進行共表達網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)502對lncRNA-mRNA存在共表達關系，其中439對lncRNA-mRNA為正相關，63對為負相關。LncRNA CTD-2384A14.2-mRNA SMCHD1、lncRNA RP1-240B8.3-mRNA BAIAP2L2和lncRNA RP11-474I

8、16.8-mRNA MIF具有最高的負相關系數(shù)。lncRNARP11-710F7.3-mRNA MSL2、 lncRNA XLOC_006166-mRNA Cxorf27和 lncRNAXLOC_009300-mRNA MMP1具有最高的正相關系數(shù)。結果顯示LncRNA AX747860和lncRNA RP11-119F7.5有最多的靶基因，各15個。
　　5.對差異表達的lncRNAs進行其與mRNA基因位置關系分析，差異表達的

9、lncRNAs與mRNA有6種位置關系，可將5738個lncRNAs分為269個intronsense-overlapping lncRNAs、317個 exon sense-overlapping lncRNAs、674個intronic antisense lncRNAs、656個natural antisense lncRNAs、3,505個intergenic lncRNAs和317個bidirectional LncRNAs。

10、其中，lncRNAENST00000425771是intergenic lncRNAs，已發(fā)現(xiàn)其與多種細胞增殖有關;LncRNANR_038439是intronic antisense lncRNA，其鄰近基因是與T型鈣離子通道相關的基因CACNA1G; LncRNA uc001kgu.3是exon sense-overlapping lncRNA，其鄰近基因為KIF20B，此基因與細胞增殖周期相關。
　　6.對通過lncRNA-

11、mRNA共表達網(wǎng)絡分析和基因位置關系分析得到的靶基因進行顯著性功能分析和信號通路分析，結果顯示這些靶基因的主要富集功能為心血管系統(tǒng)發(fā)育，主要富集的信號通路為致心律失常性心肌病通路和p53通路。
　　7.利用BLAST對差異lncRNAs進行人與小鼠序列比對后，發(fā)現(xiàn)lncRNAASHGA5P003269和lncRNA ENST00000523269在小鼠中存在相似序列，分別為lncRNA NR_045363.1和lncRNA NR_

12、045402。
　　8.通過實時熒光定量PCR驗證差異表達的lncRNAs，顯示結果與芯片分析結果一致。
　　結論:
　　1.通過lncRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)了胎兒組和成人組差異表達的lncRNAs和mRNAs。
　　2.通過對胎兒與成人心肌差異表達mRNAs進行顯著性功能分析和信號通路分析，明確了差異mRNA可能參與生物學功能。
　　3.通過分析差異lncRNAs和差異mRNAs的共表達關系以及差異lncRN