胎兒與成人心肌中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的:
　　胎兒心臟約在妊娠10周時已經(jīng)成型，在之后的心臟發(fā)育過程中，胎兒心肌在能量代謝、心肌纖維排列和心肌細(xì)胞增殖能力等方面發(fā)生很大變化。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA參與多種器官的發(fā)育過程，因此，我們推測lncRNA的表達(dá)可能會影響心臟的發(fā)育過程。本課題組擬通過lncRNA芯片分析13-17周胎兒心肌和30-40歲成年人心肌組織的差異lncRNAs和mRNAs表達(dá)，通過生物信息學(xué)分析差異lncRNAs的生物學(xué)功能，為探討lncRNA

2、s在心臟發(fā)育中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.收集6例13-17周胎兒心臟和6例30-40歲成年人心臟，取各例部分組織做HE染色觀察胎兒和成人心肌纖維排列情況;Masson染色觀察膠原含量情況;免疫熒光染色觀察胎兒和成人心臟的心肌細(xì)胞增殖情況。提取各例左心室組織總RNA。
　　2.通過lncRNA芯片，檢測胎兒和成人心臟組織的lncRNA和mRNA表達(dá)譜，以胎兒組和成人組差異倍數(shù)大于或等于2、P值小于或等于0

3、.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于或等于0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出胎兒組和成人組存在的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs。
　　3.對差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行顯著性功能分析(GO Analysis)和顯著性信號通路分析(Pathway Analysis)，得到胎兒與成人心肌差異表達(dá)mRNAs所參與的顯著性功能和信號通路。
　　4.建立差異lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)預(yù)測差異表達(dá)lncRNAs的靶基因，以皮爾遜

4、相關(guān)系數(shù)絕對值大于或等于0.9998和P值小于0.001為標(biāo)準(zhǔn)，找到差異表達(dá)lncRNA可能的靶基因;分析差異表達(dá)lncRNA與mRNA的基因位置關(guān)系，利用cis分析差異表達(dá)lncRNAs可能相關(guān)的靶基因;對差異lncRNAs的預(yù)測靶基因進(jìn)行顯著性功能分析，得到差異基因所參與的顯著性、靶向性功能;對差異lncRNAs的靶基因進(jìn)行顯著性信號通路分析，得到差異基因所參與的顯著性信號通路。
　　5.利用BLAST對差異倍數(shù)大于10倍的l

5、ncRNA進(jìn)行人與小鼠間的序列比對。
　　6.實時熒光定量PCR技術(shù)驗證差異表達(dá)的lncRNAs:選取具有代表性的差異表達(dá)的lncRNAs，采用熒光定量PCR技術(shù)驗證其在胎兒組和成人組的差異表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色顯示成人心肌纖維排列較胎兒心肌纖維更整齊有序，成人心肌纖維為長條形，而胎兒心肌纖維為多角形;Masson染色顯示成人心肌有更高的膠原含量;免疫熒光染色結(jié)果顯示13-17周胎兒心肌可見的明顯的增殖心

6、肌細(xì)胞，而成人心肌中無心肌細(xì)胞增殖。
　　2.lncRNA芯片分析結(jié)果顯示，胎兒組和成人組存在5738個差異表達(dá)的lncRNAs，其中2538個在成人組發(fā)生下調(diào)，3200個發(fā)生下調(diào)。差異表達(dá)的mRNA有5547個，其中在成人組下調(diào)的有3220個，上調(diào)的有2327個。
　　3.對差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行顯著性功能分析和顯著性信號通路分析，結(jié)果顯示成人組下調(diào)mRNAs參與52個顯著性功能類別和20個信號通路，主要與細(xì)胞周期相關(guān);成

7、人組上調(diào)mRNAs參與23個功能類別和10個信號通路，主要與抗原性及離子通道相關(guān)。
　　4.對差異表達(dá)的lncRNAs和差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)502對lncRNA-mRNA存在共表達(dá)關(guān)系，其中439對lncRNA-mRNA為正相關(guān)，63對為負(fù)相關(guān)。LncRNA CTD-2384A14.2-mRNA SMCHD1、lncRNA RP1-240B8.3-mRNA BAIAP2L2和lncRNA RP11-474I

8、16.8-mRNA MIF具有最高的負(fù)相關(guān)系數(shù)。lncRNARP11-710F7.3-mRNA MSL2、 lncRNA XLOC_006166-mRNA Cxorf27和 lncRNAXLOC_009300-mRNA MMP1具有最高的正相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示LncRNA AX747860和lncRNA RP11-119F7.5有最多的靶基因，各15個。
　　5.對差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行其與mRNA基因位置關(guān)系分析，差異表達(dá)的

9、lncRNAs與mRNA有6種位置關(guān)系，可將5738個lncRNAs分為269個intronsense-overlapping lncRNAs、317個 exon sense-overlapping lncRNAs、674個intronic antisense lncRNAs、656個natural antisense lncRNAs、3,505個intergenic lncRNAs和317個bidirectional LncRNAs。

10、其中，lncRNAENST00000425771是intergenic lncRNAs，已發(fā)現(xiàn)其與多種細(xì)胞增殖有關(guān);LncRNANR_038439是intronic antisense lncRNA，其鄰近基因是與T型鈣離子通道相關(guān)的基因CACNA1G; LncRNA uc001kgu.3是exon sense-overlapping lncRNA，其鄰近基因為KIF20B，此基因與細(xì)胞增殖周期相關(guān)。
　　6.對通過lncRNA-

11、mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和基因位置關(guān)系分析得到的靶基因進(jìn)行顯著性功能分析和信號通路分析，結(jié)果顯示這些靶基因的主要富集功能為心血管系統(tǒng)發(fā)育，主要富集的信號通路為致心律失常性心肌病通路和p53通路。
　　7.利用BLAST對差異lncRNAs進(jìn)行人與小鼠序列比對后，發(fā)現(xiàn)lncRNAASHGA5P003269和lncRNA ENST00000523269在小鼠中存在相似序列，分別為lncRNA NR_045363.1和lncRNA NR_

12、045402。
　　8.通過實時熒光定量PCR驗證差異表達(dá)的lncRNAs，顯示結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.通過lncRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)了胎兒組和成人組差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs。
　　2.通過對胎兒與成人心肌差異表達(dá)mRNAs進(jìn)行顯著性功能分析和信號通路分析，明確了差異mRNA可能參與生物學(xué)功能。
　　3.通過分析差異lncRNAs和差異mRNAs的共表達(dá)關(guān)系以及差異lncRN