牛丘疹性口炎病毒的分離、全基因組測序及其生物信息學分析.pdf

1、牛丘疹性口炎病(BPS)是牛的一種高度傳染性的、普遍存在的疾病，該病由牛丘疹性口炎病毒引起。它是能引起牛和人的一種急性、接觸性、嗜上皮性傳染病。牛丘疹性口炎病的特點是常在皮膚或嘴唇的粘膜，齒墊，上顎，舌頭，乳房，口角出現(xiàn)丘疹和潰瘍。在牛丘疹性口炎流行地區(qū)，發(fā)病率可高達90％以上，死亡率較低，但能使牛哺乳期中斷和產(chǎn)奶量下降，影響牛肉和皮的品質(zhì)，還會引起續(xù)發(fā)感染。國內(nèi)外對該病的致病機理還沒有系統(tǒng)的研究和報道，基因組序列的數(shù)據(jù)稀少，有關基因功

2、能的研究更加稀少，因此希望能夠通過我們的研究，為牛丘疹性口炎病的研究提供一定的基礎。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.通過觀察牛病理特征，采集病料做病理切片，病毒接種于細胞分離，病毒形態(tài)電鏡顯示成卵圓形，以及PCR的特異性檢測，基因產(chǎn)物的測序和比對，檢測和分離到了牛丘疹性口炎病毒。
　　三歲的安格斯公牛，已有兩個月的慢性肩部感染，頸部、腹部皮膚有突起的結(jié)節(jié)，尸檢肩部出現(xiàn)膿腫膿液，多個淺表淋巴結(jié)腫大。并且在牛前肢兩側(cè)末端皮膚有慢性皮

3、膚增殖病和腫脹。四肢皮膚廣泛性病理增生，皮膚潰瘍出血病有灶融合。組織病理學檢查顯示前肢上皮乳頭狀增生、過度角質(zhì)化、真皮炎癥浸潤。角化細胞氣球樣變性和可見到嗜酸性胞漿內(nèi)包涵體的等特征。電鏡檢查顯示出典型的卵圓形副痘病毒屬病毒粒子。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的牛丘疹性口炎病毒BPSV-024基因序列設計PCR引物，并且用PCR技術從病毒(TX09)感染的細胞中擴增到了預期的目的條帶。該擴增的DNA序列通過核苷酸比對，結(jié)果顯示與牛丘疹性口炎病毒AR02株的

4、同源性達到100％，通過病理學，電鏡，PCR擴增特異條帶，序列分析確定該病毒為牛丘疹性口炎病毒。
　　2.牛丘疹性口炎病毒全基因組測序與C5、C15和C1病毒的分離純化為了進一步研究評估臨床分離的牛丘疹性口炎病毒基因組特性，用該病毒感染細胞并進行病毒的DNA提取，用Illumina MiSeq平臺的第二代測序相關技術設備進行全基因測序分析。根據(jù)對所得結(jié)果的初步分析，該序列和當前已發(fā)表的基因庫序列牛丘疹性口炎病毒AR02株(基因庫A

5、cc.AY386265)，存在高度相似，值得注意的是，幾個基因位點有明顯的異質(zhì)性，表明臨床分離病毒中存在幾種基因型的情況。
　　從第一次分離的病毒，全基因測序后發(fā)現(xiàn)，同一樣品中測序結(jié)果顯現(xiàn)出3種相似度很高的基因序列情況，為了便研究病毒基因的特性，命名為C5、C15、C1，我們用病毒蝕斑純化的方法進行病毒的分離，根據(jù)其各自基因酶切位點的不同和基因的特異性，分別用stuⅠ酶酶切鑒定C5-VEGF和C15-VEFG基因來篩選C5和C15

6、病毒;PCR檢測特殊基因ATI，蝕斑行篩選純化C1病毒。通過多代的篩選純化，最終得到了相似度很高C5、C15、C1病毒。
　　3.對篩選到的牛丘疹性口炎病毒基因進行測序比對
　　對篩選到的C5、C15和C1牛丘疹性口炎病毒，再進行全基因測序，基因序列開放閱讀框(ORF)的確定使用EMBOSS工具和田納西州大學橡樹嶺國家實驗室的Prodigal程序分析，分別找到了132個開放閱讀框，標注了基因的起始和終止位置，并且和已經(jīng)發(fā)表的

7、牛丘疹性口瘡病毒基因庫序列AR02(基因庫Acc.AY386265)進行比對。注明了其相對位置和標注其蛋白功能，表格列出了3株病毒中差異明顯的開放閱讀框共17個(ORF006，ORF008，ORF009，ORF012，ORF020, ORF029, ORF102, ORF103, ORF104, ORF109, ORF110, ORF118,ORF119, ORF120, ORF123, ORF123,ORF124,ORF127)。

8、r>　　4.C5、C15和C1病毒動物接種試驗
　　用純化到的C5、C15和C1病毒感染細胞，不同時間段收病毒，檢測TCID50繪制生長曲線，結(jié)果顯示C5、C15和C1病毒表現(xiàn)了類似生長趨勢。并用病毒C5、C15和C1分別接種家兔進行動物接種試驗，家兔在接種的7天顯現(xiàn)膿皰，第11天膿皰破潰，2周后結(jié)痂痊愈，且在結(jié)痂中檢測到了相應的病毒。
　　5.用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選了與C1-ORF118相互作用蛋白
　　以ORF1

9、18基因序列為模板，特異性引物擴增ORF118基因，并連接到pGBKT7酵母表達載體上，構(gòu)建pGBKT7-ORF118誘餌載體，并對構(gòu)建好的誘餌載體進行鑒定、自激活檢測和細胞毒性檢測。PCR結(jié)果和雙酶切得到了579bp大小目的條帶。誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Ⅱ8轉(zhuǎn)Y187和AH109感受態(tài)細胞，且培養(yǎng)于缺陷培養(yǎng)基SD/-TRP/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu，培養(yǎng)基上均無菌落生長，在培養(yǎng)基S

10、D/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal僅生長白色菌落，表明誘重組誘餌質(zhì)粒對Y2HGold酵母無毒性和自激活效應?？梢杂糜贛DBK細胞的cDNA文庫進行酵母雙雜交篩選。
　　利用酵母雙雜交技術，將所構(gòu)建的pGBKT7-118誘餌載體與MDBK的cDNA文庫進行雜交，用SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-α-gal缺陷性固體培養(yǎng)基篩選相互作用的蛋白。經(jīng)過多輪篩選，得到了