利用Ion Torren測(cè)序平臺(tái)和生物信息學(xué)分析幾株細(xì)菌和病毒基因組.pdf

1、病毒，一種特殊的生命體，具有嚴(yán)格的活細(xì)胞寄生的生存方式，可寄生在人、動(dòng)植物、昆蟲(chóng)、真菌和細(xì)菌等細(xì)胞中而引起感染。75％的人類傳染病由病毒引起。
　　病毒的一個(gè)增殖周期包括:通過(guò)識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體而進(jìn)入宿主或?qū)⑦z傳物質(zhì)注入宿主（噬菌體）、以自身核酸為模板合成子代遺傳物質(zhì)，子代蛋白的轉(zhuǎn)錄、子代病毒顆粒的包裝、從宿主體內(nèi)釋放、新的宿主細(xì)胞的再感染。
　　噬菌體，作為細(xì)菌病毒，其復(fù)制周期與病毒類似。dsDNA噬菌體基因組利用末端重

2、復(fù)序列進(jìn)行環(huán)化，從而通過(guò)滾環(huán)復(fù)制方式(rolling circle replication)復(fù)制出許多多聯(lián)體DNA(concatemeric DNA)，以該DNA為底物，包裝酶對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和切割，進(jìn)而產(chǎn)生子代基因組DNA，包裝進(jìn)頭部蛋白(prohead)，最終得到子代病毒顆粒。在這個(gè)過(guò)程中，復(fù)制和組裝對(duì)噬菌體和病毒至關(guān)重要。因此，該過(guò)程的研究對(duì)病毒學(xué)的發(fā)展具有關(guān)鍵作用。復(fù)制和組裝與病毒基因組的末端序列密切相關(guān)，復(fù)制過(guò)程需要通過(guò)末端進(jìn)行環(huán)

3、化，從而起始復(fù)制，包裝通過(guò)切割產(chǎn)生子代DNA的末端，從而決定下一代的復(fù)制，因此，對(duì)病毒基因組末端的研究至關(guān)重要。而傳統(tǒng)的末端研究方法需大量人力和時(shí)間，且易丟失細(xì)節(jié)。因此，迫切需要尋找一種通量高、準(zhǔn)確度高及快速的末端分析方法。
　　虹彩病毒(iridovirus)，雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于虹彩病毒科。被其感染的個(gè)體在受到斜射光照射時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出紫色或者藍(lán)色的彩虹，而得名。屬于虹彩病毒科的虹彩病毒屬和綠虹彩病毒屬為無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒II

4、Vs，主要感染昆蟲(chóng)。IIVs對(duì)昆蟲(chóng)可導(dǎo)致亞致死以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，其也可用于殺蟲(chóng)劑。目前，對(duì)該病毒的功能及其與宿主的相互作用等研究較少;其次， Genbank上只有4珠IIVs的全基因組序列，因此，迫切需要對(duì)更多IIVs進(jìn)行全基因測(cè)序，從而為該病毒科的遺傳研究及各方面的功能研究提供指導(dǎo)。
　　炭疽桿菌，是全球傳播的嚴(yán)重的人畜共患病——炭疽病的病原體。同時(shí)，也是恐怖主義和生物武器的病原體。1993年日本炭疽桿菌氣溶膠襲擊事件和2

5、001年美國(guó)炭疽桿菌信件事件，都為快速準(zhǔn)確的分型方法的產(chǎn)生提供了挑戰(zhàn)。需要一種分型方法來(lái)區(qū)分一次疫情是由炭疽桿菌的自然爆發(fā)或是恐怖主義對(duì)微生物的故意釋放，從而對(duì)不同緊急事件進(jìn)行不同的處理。
　　然而，炭疽桿菌具有非常高的種間基因組同源性，以及非常低的多樣性，即使經(jīng)歷了20至40代的“感染—死亡—感染”循環(huán)后，其基因組的遺傳組成幾乎保持不變，因此分型非常困難。
　　目前具有兩種有效的分型方法，單堿基多態(tài)性(SNP: singl

6、e nucleotidepolymorphism)和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA: multiple locusvariable number tandem repeat analysis)，這兩種方法具有較高的分辨率，大大的增強(qiáng)了炭疽桿菌株間的辨別。但SNP具有偏向性(bias)且在很接近的株間存在較少，MLVA方法分析結(jié)果不穩(wěn)定，不同的實(shí)驗(yàn)室得到結(jié)果具有較大差異，因此，迫切需要尋找一種分辨率更高，更準(zhǔn)備的炭疽分型方法以及

7、炭疽溯源方法，來(lái)處理炭疽引起的嚴(yán)重的事件如傳染病和恐怖事件。
　　摩氏摩根菌為革蘭氏陰性厭氧菌，是腸桿菌科摩根菌屬唯一菌種，可對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類型的抗生素呈現(xiàn)固有耐藥，是可引起嚴(yán)重感染的條件致病菌，常引起院內(nèi)感染，包括泌尿道感染和術(shù)后感染及多種炎癥。國(guó)內(nèi)外報(bào)道該菌感染的發(fā)病率逐年增多。其已經(jīng)成為醫(yī)院里獲得性感染的常見(jiàn)致病菌之一。
　　高通量測(cè)序技術(shù)(HTS，high-throughput sequencing)具有通量高、準(zhǔn)

8、確性高、快速等特點(diǎn)，且成本越來(lái)越低。因此，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用到了生物研究的各個(gè)領(lǐng)域，例如，對(duì)有參考序列的物種的重測(cè)序(resequencing)、對(duì)無(wú)參考序列的基因組的從頭測(cè)序、為探測(cè)未知病毒對(duì)特定長(zhǎng)度的小RNA的測(cè)序、為探測(cè)基因的表達(dá)量對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序。
　　目前主流高通量測(cè)序平臺(tái)包括Illumina的Miseq和Hiseq2000、Roche454及Life technology的Ion Torrent。Illumina公司的測(cè)序

9、儀準(zhǔn)確度高，通量大，因而被使用最多，但其運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)、讀長(zhǎng)較短。454雖具有較長(zhǎng)讀長(zhǎng)，但成本卻很高。Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)具有速度快和成本低的特點(diǎn)，可被用來(lái)對(duì)病毒和細(xì)菌進(jìn)行全基因組測(cè)序。
　　我們通過(guò)對(duì)噬菌體和病毒基因組高通量測(cè)序結(jié)果的分析，確定了測(cè)序結(jié)果中存在的高頻序列(HFS)是病毒基因組末端序列。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的生物信息學(xué)分析方法，我們利用HFS數(shù)據(jù):i）可以同時(shí)獲得病毒全基因組和末端序列;ii）建立了一個(gè)判定每個(gè)

10、病毒基因組末端類型和包裝機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn);iii）鑒定額外的關(guān)于病毒基因組末端序列的細(xì)節(jié)特征，如末端重復(fù)、次要末端及多個(gè)末端等;iv）T4類噬菌體的基因組被末端酶切割時(shí)是以一種序列傾向性的方法進(jìn)行而非完全隨機(jī)，修正了之前的相關(guān)報(bào)道;v) N4類噬菌體具有獨(dú)特的末端特征，即左側(cè)均一，右側(cè)具有2組不同的異質(zhì)性末端。利用這個(gè)技術(shù)，我們首次鑒定出了金黃色葡萄球菌噬菌體基因組左側(cè)末端均一，而右側(cè)末端隨機(jī)的特性。另外，我們也提出了病毒基因組重復(fù)序列長(zhǎng)度的

11、計(jì)算公式。我們的結(jié)果簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)末端分析的流程。理論上，這個(gè)方法可進(jìn)一步用到植物和動(dòng)物病毒基因組末端研究，以及其他小的基因組。本文第一章的研究展示了一個(gè)快捷的、有效的末端分析方法，這將為病毒復(fù)制、包裝、末端酶功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及宿主和病毒代謝的研究提供有力支持。
　　虹彩病毒AMIV分離自2012年從云南收集的蚊子研磨勻漿。將勻漿加入C3/36細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞病變CPE，盲傳三代后仍能觀察到CPE，因而確定為陽(yáng)性分離結(jié)果。而

12、后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，濃縮和純化后提取基因組，進(jìn)行shotgun和matepair高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析，i）獲得全基因組序列;ii)經(jīng)BLAST分析鑒定為虹彩病毒:iii）經(jīng)過(guò)比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)其與已知的虹彩病毒序列非常不同;iv）經(jīng)過(guò)分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其為新的虹彩病毒基因型;v)利用透射電鏡發(fā)現(xiàn)其為標(biāo)準(zhǔn)的二十面體結(jié)構(gòu)，具有直徑為180nm的蛋白外殼，為有包膜病毒，vi）利用熒光顯微鏡獲得了詳細(xì)的CPE過(guò)程，即9小時(shí)便可致細(xì)胞病變，

13、36小時(shí)可讓全部細(xì)胞裂解，提示該病毒可作為病蟲(chóng)害的殺蟲(chóng)劑，vii）通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AMIV基因組上，存在末端冗余序列(TR)，約基因組的10％，TR序列保證了每個(gè)病毒顆粒從親代DNA那兒至少獲得一個(gè)拷貝的每個(gè)基因，在進(jìn)化上具有優(yōu)勢(shì)，viii）對(duì)AMIV快速?gòu)?fù)制機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了保守的與宿主DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的bro-like基因，且具有12個(gè)拷貝，文獻(xiàn)報(bào)道具有快速?gòu)?fù)制能力的囊泡病毒具有多個(gè)拷貝的bro-like基因，因此這提示

14、其可能與AMIV快速?gòu)?fù)制相關(guān);另外，通過(guò)對(duì)AMIV基因組進(jìn)行功能注釋，一共發(fā)現(xiàn)54個(gè)功能已知的基因，這其中與復(fù)制相關(guān)的基因就有20個(gè)，約占功能已知基因的40％，這保證基DNA復(fù)制高效進(jìn)行，這可能是該病毒快速?gòu)?fù)制的另一個(gè)原因。
　　2012年8月，遼寧省爆發(fā)了炭疽疫情，該疫情致7人和上百頭牛感染，一株從死牛身上分離到的毒株han和當(dāng)?shù)厮靡呙缰陃ac，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二者對(duì)小鼠毒性都很低，因此有人懷疑本次疫情是由炭疽疫苗株引起。為

15、驗(yàn)證該假設(shè)，我們對(duì)兩株炭疽桿菌進(jìn)行了高通量測(cè)序。利用高通量測(cè)序，我們對(duì)這兩株細(xì)菌進(jìn)行了關(guān)鍵位點(diǎn)SNP(canonical SNP)分型，結(jié)果顯示，毒株han和疫苗株vac是完全不同的兩株細(xì)菌。利用MLVA分型發(fā)現(xiàn)han株與已報(bào)道的中國(guó)本土株聚為一類，但同時(shí)，又具有其獨(dú)自的進(jìn)化分支，故為一株新發(fā)的中國(guó)本土株。另外，我們還提出了具有比傳統(tǒng)分型方法更高分辨率的基于序列的MLVA(sequence-based MLVA)分型方法，利用該方法驗(yàn)證