人腸三葉因子在大腸桿菌和酵母中的表達(dá)、純化及其在受損胃腸粘膜屏障重建中的作用.pdf

1、背景： 腸三葉因子(intestinaltrefoilfactor，ITF)是由腸道杯狀細(xì)胞特異分泌的包含59個(gè)氨基酸的小分子多肽，ITF氨基酸序列中有一段特殊的核心序列，其間的6個(gè)半胱氨酸按1-5，2-4和3-6的順序，依次以二硫鍵兩兩相接，形成3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，形如三片葉子，故名腸三葉因子。ITF除具有一般生長(zhǎng)因子的共性外，還因其具有特殊的空間結(jié)構(gòu)能同粘蛋白(Mucin)的糖鏈結(jié)合，形成穩(wěn)定的凝膠復(fù)合物，維護(hù)胃腸粘液層。因此，I

2、TF可減輕多種致傷因子造成的胃腸道損害，在消化道的自我保護(hù)機(jī)制中占據(jù)重要地位。作為一個(gè)具有廣泛應(yīng)用前景的藥物前體ITF已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，ITF特異的空間結(jié)構(gòu)既是其生物活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是人工合成的難點(diǎn)所在。目前人工獲取ITF一般有三種途徑：化學(xué)合成、組織提取和基因重組表達(dá)?；瘜W(xué)合成較為昂貴、煩瑣，且無(wú)法獲得正確的空間結(jié)構(gòu)；組織提取原料來(lái)源有限，阻礙了其廣泛應(yīng)用；基因重組技術(shù)無(wú)疑是獲得ITF的最佳選擇，但目前原核系統(tǒng)表達(dá)ITF產(chǎn)

3、量低，僅為3-4mg/L。采用第一代釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，盡管實(shí)驗(yàn)室表達(dá)量已達(dá)100mg/L，但因其不具備高密度發(fā)酵的特性，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)，工業(yè)化生產(chǎn)受限。第二代畢赤酵母是一種新型表達(dá)系統(tǒng)，除保留第一代釀酒酵母的一些優(yōu)點(diǎn)外，還增加了高密度發(fā)酵的特點(diǎn)，能大規(guī)模表達(dá)目的蛋白，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，目前已利用此系統(tǒng)表達(dá)了一系列有重要生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，如破傷風(fēng)毒素片段C、腸激酶、乙肝表面抗原、腫瘤壞死因子、表皮生長(zhǎng)因子、白介素11等。 目

4、的： 篩選并構(gòu)建rhITF理想的表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化表達(dá)條件，提高表達(dá)產(chǎn)量，獲得高純度的重組蛋白；對(duì)重組表達(dá)的rhITF的理化性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究；探討rhITF在受損胃腸粘膜屏障重建中的作用。 方法： 1.rhITF在大腸桿菌中的表達(dá)和純化：通過(guò)RT-PCR獲得rhITF成熟肽全長(zhǎng)基因序列，克隆至質(zhì)粒pET32a獲得重組載體；雙酶切和測(cè)序后轉(zhuǎn)化至OrigamiB(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件獲得最大表達(dá)產(chǎn)量；Ni-

5、NTA親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE、Westernblot鑒定重組蛋白。 2.rhITF在酵母中的表達(dá)和純化：重組載體的構(gòu)建同方法1，BspHI線性化后氯化鋰轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母X-33，Zeocin篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR驗(yàn)證目的基因；挑取陽(yáng)性克隆于YPD中進(jìn)行組成性表達(dá)，表達(dá)上清經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、Ni-NTA親和層析、超濾離心，純化出rhITF；TricineSDS-PAGE、Westernblot鑒定重組蛋白。

6、 3.rhITF的鑒定：純化后重組蛋白進(jìn)行N端測(cè)序及肽指紋圖譜分析，進(jìn)一步鑒定重組蛋白；質(zhì)譜分析測(cè)定重組蛋白分子量，明確是否產(chǎn)生糖基化。 4.rhITF理化性質(zhì)的研究：將純化后的rhITF分別置于以下液體環(huán)境：①不同濃度的蛋白酶，37℃消化4h；②pH值2.0-12.0的緩沖液中，37℃5h；③pH7.8緩沖液37℃水浴1-5d。采用Non-reducingTricineSDS-PAGE分析殘余rhITF的百分比，觀察在模擬

7、胃腸道環(huán)境中rhITF的穩(wěn)定性。 5.rhITF體外生物學(xué)活性研究：①采用MTT法觀察rhITF對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖活性的影響；②采用燒傷血清致IEC-6細(xì)胞損傷模型，觀察rhITF對(duì)IEC-6細(xì)胞的保護(hù)作用；③采用IEC-6細(xì)胞機(jī)械損傷模型，觀察rhITF對(duì)IEC-6細(xì)胞移行速率的影響。 6.rhITF體內(nèi)生物學(xué)活性研究：采用30％體表面積(totalbodysurfacearea，TBSA)III。燒傷小鼠模型，觀察

8、rhITF對(duì)燒傷小鼠胃腸粘膜損傷和修復(fù)的影響。 結(jié)果： 1.獲得hITF成熟肽全長(zhǎng)基因序列，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的基因序列完全一致，成功構(gòu)建含目的基因的重組載體pET32a-hITF；優(yōu)化表達(dá)條件后，重組蛋白的產(chǎn)量約10mg/L;Westernblot證明重組蛋白具有良好的抗原性和特異性；通過(guò)Ni-NTA親和層析，得到70％純度的重組蛋白。 2.成功構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pGAPZαA-hITF，篩選出整合

9、hITF成熟肽基因的穩(wěn)定酵母菌株；組成性表達(dá)的產(chǎn)量為50mg/L，三步純化后rhITF的純度超過(guò)95％；Westernblot證明rhITF具有良好的抗原性和特異性。 3.N端測(cè)序結(jié)果與理論序列完全一致，肽指紋圖譜的匹配率為100％，質(zhì)譜分析顯示rhITF的分子量為7,879.38Da，與理論值(7679.7Da)基本一致。 4.rhITF在蛋白酶/rhITF的比例高達(dá)1：1時(shí)，經(jīng)過(guò)4h消化，rhITF二聚體殘余量超過(guò)5

10、0％；在pH值2.0-12.0的緩沖液中，37℃水浴5h后，殘余量均超過(guò)90％；pH7.8緩沖液37℃水浴5d，殘余量超過(guò)70％。 5.rhITF可明顯降低燒傷血清致IEC-6細(xì)胞損傷程度，反映細(xì)胞損傷的AST、LDH活性顯著下降，且作用持續(xù)12h；聯(lián)合使用粘蛋白顯著加強(qiáng)rhITF的細(xì)胞保護(hù)作用，ALT、AST、LDH活性顯著降低，且保護(hù)作用延長(zhǎng)至48h(P＜0.01)。rhITF可以加快IEC-6細(xì)胞移行速度，是對(duì)照組的2-3

11、倍(P＜0.01)。各種濃度的rhITF對(duì)于IEC-6細(xì)胞具有一定的促增殖作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.19)。 6.燒傷小鼠每天給予lmg/kg的rhITF灌胃，顯著降低胃腸粘膜受損程度，胃粘膜損傷指數(shù)明顯下降(5.33士4.58vs0.6士1.26，P＜0.01)；胃腸病理改變明顯減輕，燒傷對(duì)照組以出血、壞死和潰瘍?yōu)橹?，ITF組以充血、水腫為主，同時(shí)腸粘膜厚度、絨毛高度、隱窩深度明顯增加，小鼠5天病死率有所下降(27.3

12、％vs45.6％)。 結(jié)論： 1.rhITF在大腸桿菌及酵母兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)均取得成功，但從重組蛋白產(chǎn)量、純度和純化程序相比較，酵母為rhITF的理想表達(dá)系統(tǒng)。 2.酵母表達(dá)的rhITF一級(jí)結(jié)果正確，信號(hào)肽酶切完全，未發(fā)生糖基化，具有良好的抗原性，自然狀態(tài)下以二聚體為主要形式。 3.rhITF是一種高度穩(wěn)定的小分子蛋白，具有極強(qiáng)的蛋白酶抗性，酸、堿及熱穩(wěn)定性。 4.體外實(shí)驗(yàn)證明，rhITF對(duì)腸上皮細(xì)