gfp在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)解析

1、實(shí)驗(yàn)八：GFP在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè),XIAMEN UNIVERSITY,宋 剛 2188275 gangsongsd@hotmail.com廈門大學(xué)抗癌研究中心,一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)和方法。復(fù)習(xí)SDS-PAGE的制備及其分離原理。,二．原核表達(dá)的一般流程,獲得目的基因 → → 準(zhǔn)備表達(dá)載體 → → 將目的基因插入表達(dá)載體中（測(cè)序驗(yàn)證） → → 轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌 → → 誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá) →

2、 → 表達(dá)蛋白的分析→ →擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè),原核表達(dá)：將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點(diǎn)： ——易于生長(zhǎng)和控制； ——用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴； ——有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒可供選擇。 ——但是，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由

3、于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。,三．實(shí)驗(yàn)原理,表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件： ——選擇標(biāo)志的編碼序列； ——可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子； ——轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn))； ——一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭； ——宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。,原核表達(dá)載體：,pET載體系統(tǒng),本實(shí)驗(yàn)

4、介紹一種常用的表達(dá)載體――pET載體系統(tǒng)。 ——在pET系列載體中，外源基因的表達(dá)受T7噬菌體RNA聚合酶的調(diào)控，這類載體是Studier等于1990年首先構(gòu)建的，后來(lái)得到很大發(fā)展。 ——帶有pBR322的大腸菌素E1 (colEl)復(fù)制區(qū)。從而賦予宿主菌氨節(jié)青霉素或卡那霉素抗性。在這些載體中，編碼序列在多克隆位點(diǎn)插入，置于天然T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子(φ10啟動(dòng)子)或所謂的T7 lac啟動(dòng)子的控制之下，后者是帶有l(wèi)ac操縱子(

5、 larO)序列的天然T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的衍生體。lac阻抑物的結(jié)合能阻斷轉(zhuǎn)錄起始。,將外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的pET-30a表達(dá)載體（如圖1）中，讓其在E.coli中表達(dá)。先讓宿主菌生長(zhǎng)，lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lacI操縱基因結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，此時(shí)宿主菌正常生長(zhǎng)。然后向培養(yǎng)基中加入lac操縱子的誘導(dǎo)物IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則DNA外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高

6、效表達(dá)，表達(dá)蛋白可經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。,,,,,SDS-PAGE分離蛋白原理,組成蛋白質(zhì)的氨基酸在一定pH的溶液中會(huì)發(fā)生解離而帶電，帶電的性質(zhì)和帶電量的多少取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)及溶液的pH值和離子強(qiáng)度。聚丙烯酰胺凝膠在催化劑過硫酸銨（簡(jiǎn)稱Ap）和加速劑N,N,N’N’-四甲基乙二胺（簡(jiǎn)稱TEMED）的作用下，聚合形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)在凝膠中受電場(chǎng)的作用而發(fā)生遷移，不同種蛋白在凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中遷移的速率不同，其速率取決于蛋白質(zhì)所

7、帶電荷的多少和蛋白質(zhì)的大小和形狀。根據(jù)遷移速率的不同，可將不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。,SDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 強(qiáng)還原劑巰基乙醇可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。 蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離

8、子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。而與其所帶電荷的性質(zhì)無(wú)關(guān)。,四．實(shí)驗(yàn)材料,五．實(shí)驗(yàn)步驟,1．目的蛋白的表達(dá)（1）含外源基因的表達(dá)菌株在LB培養(yǎng)基（含50μg/ml Kana）中預(yù)培養(yǎng)過夜（2）按1/50的比例稀釋菌液，于250r/min，培養(yǎng)3小時(shí),使其OD600值達(dá)到0.6（3）加入IPTG，使其終濃度為0.5mmol/L

9、（4）繼續(xù)培養(yǎng) 小時(shí)（5）取1.5ml菌液于10000r/min，離心2min，收獲菌體,2．目的蛋白的檢測(cè)（1）凝膠制備 分離膠和濃縮膠分別按下表中的配方進(jìn)行制備。先制分離膠，將分離膠注入玻板后，用去離子水封口，約30~40min后凝聚。將膠面的水吸干后灌注濃縮膠，并插入梳子，膠凝固后即可。（2）凝膠電泳 取80 ml 電極緩沖液稀釋5倍后，分別注入陰極電泳槽和陽(yáng)極電泳槽中。然后在加樣孔中加入已經(jīng)處理

10、好的蛋白樣品。80V恒壓20分鐘，120V恒壓2小時(shí) （3）染色、脫色 電泳完畢，剝膠后，在搖床上染色0.5~1 小時(shí)；之后，在脫色液中脫色1小時(shí)，觀察目的蛋白表達(dá)情況。,五．注意事項(xiàng),1．含外源基因的表達(dá)菌株應(yīng)預(yù)培養(yǎng)之后再轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)瓶中，最好不要將菌種直接接于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)。2．表達(dá)菌生長(zhǎng)至OD600值0.6左右為誘導(dǎo)適合條件，避免菌生長(zhǎng)過濃。3．配制SDS膠時(shí)應(yīng)注意充分混勻后加入玻璃板中，并待其充分凝固后使用。,