半夏蛋白純化、表達(dá)及其活性研究.pdf

1、半夏(Pinelliaternata(Thunb.)Breit)為天南星科半夏屬植物，以塊莖入藥，是一種傳統(tǒng)中藥，主要成分有蛋白、多糖、生物堿和有機(jī)酸等。半夏塊莖有燥濕化痰、散結(jié)、降逆止嘔等功效。研究表明半夏塊莖具有抗早孕、抗腫瘤、抗蟲、抗病毒、抗真菌、抗心律失常、促有絲分裂、降血脂和凝血等作用。半夏蛋白主要由半夏胰蛋白酶抑制劑和半夏凝集素組成。
　　植物蛋白酶抑制劑和凝集素具備多種生物學(xué)功能活性，目前商業(yè)應(yīng)用已經(jīng)很廣泛。本研究設(shè)

2、計(jì)單步Trypsin-Sepharose4B親和柱層析法來親和分離純化半夏胰蛋白酶抑制劑(Pinelliaternatatryspininhibitor，PTTI)。通過半夏塊莖組織勻漿、水提、硫酸銨梯度沉淀和Trypsin-Sepharose4B親和柱吸附及洗脫，得到一種新的蛋白酶抑制劑。SDS-PAGE顯示純化的半夏蛋白酶抑制的分子量為20kDa左右，應(yīng)屬于植物Kunitz型植物蛋白酶抑制劑。利用豬胰臟胰蛋白酶作為反應(yīng)酶，BAPNA

3、作為酶反應(yīng)底物，得到純化的半夏蛋白酶抑制劑的抑制比活力為366.5±14.57U/mg，純化倍數(shù)為8.6倍。硫酸-苯酚法測(cè)得該蛋白的多糖含量為12.84±0.64％，表明從半夏塊莖中的分離得到的半夏抑制劑蛋白是一種糖蛋白。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明該抑制劑對(duì)溫度和pH都相對(duì)穩(wěn)定。
　　半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin，PTA)是一種單子葉甘露糖結(jié)合型植物凝集素，是四個(gè)亞基組成的同源二聚體。本研究利用Mannose

4、-Sepharose4B親和柱建立一種新的植物凝集素分離方法，通過優(yōu)化親和分離條件，高通量純化得到半夏凝集素PTA。通過半夏塊莖組織勻漿、浸泡過夜、硫酸銨沉淀和離心，得到半夏總蛋白。半夏總蛋白分別溶于10％，15％，20％，25％和30％不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液中處理，隨后不同濃度NaCl溶液中的蛋白樣品上樣到Mannose-Sepharose4B親和柱中用以吸附PTA，淋洗掉未結(jié)合的雜蛋白后，將PBS通入Mannose-Sephar

5、ose4B親和柱中，發(fā)現(xiàn)可通過降低親和柱中緩沖液的鹽離子濃度從而將親和吸附的PTA洗脫下來。含量測(cè)定表明當(dāng)半夏總蛋白用25％NaCl溶液處理后可獲得最大的純化得率，為35.5mg/g半夏塊莖。SDS-PAGE顯示該方法分離得到的PTA分子量為12kDa左右且純度很高，約97％。凝血實(shí)驗(yàn)表明PTA濃度為6μg/mL時(shí)可以明顯凝集小鼠血細(xì)胞。本研究建立一種新的植物凝集素單步分離方法，不僅可用于甘露糖凝集素的分離，也可用于其他植物凝集素的分離

6、。該方法與傳統(tǒng)的植物凝集素分離方法相比，比如離子柱層析、凝膠過濾和豬甲狀腺球蛋白親和層析法，具有純化得率高、產(chǎn)物純度高、操作過程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)花費(fèi)少和產(chǎn)物無污染等特點(diǎn)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
　　信號(hào)肽APSP可引導(dǎo)目的肽鏈穿過細(xì)胞內(nèi)膜進(jìn)入內(nèi)膜與外膜的周質(zhì)空間內(nèi)，然后該信號(hào)肽序列被信號(hào)肽裂解酶特異性切除，獲得末端保真性肽鏈，在一系列生化酶的作用下，重組肽鏈可形成二硫鍵并且正確折疊。本研究通過PTA的結(jié)構(gòu)信息，以pta基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)

7、特異PCR引物，克隆得到編碼半夏凝集素N端結(jié)構(gòu)域肽鏈基因pta-n。根據(jù)大腸桿菌堿性磷酸酶信號(hào)肽核酸序列apsp，設(shè)計(jì)PCR引物，通過三步PCR法，將apsp核酸序列融合到pta-n的5'端，獲得融合目的基因apsp-pta-n，以期實(shí)現(xiàn)PTA-N的分泌性表達(dá)。該目的基因經(jīng)過限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后，產(chǎn)物片段與表達(dá)質(zhì)粒酶連，構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-apsp-pta-n并轉(zhuǎn)入到表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3

8、)獲得工程菌株。該工程菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲波破碎與離心，獲得細(xì)胞破碎上清液。Ni-NTA親和柱用于重組蛋白PTA-N的純化，SDS-PAGE用于證實(shí)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果。SDS-PAGE表明該目的蛋白可以可溶性表達(dá)并被Ni-NTA親和柱純化，純化得率約為20mg/L。凝血與抑制實(shí)驗(yàn)表明PTA-N(6μg/mL)能凝結(jié)小鼠血細(xì)胞。抗真菌實(shí)驗(yàn)顯示PTA-N對(duì)小麥赤霉菌Gibberellasaubinetii具有生長(zhǎng)抑制作用

9、?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)MTT法表明PTA-N對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系有生長(zhǎng)抑制作用，進(jìn)一步的Hochest33342核染色和DNA片段化分析表明PTA-N處理人類肝癌腫瘤細(xì)胞Bel-7404后可形成凋亡典型的凋亡小體和梯狀化核酸片段。這些結(jié)果證明PTA-N通過誘導(dǎo)Bel-7404發(fā)生凋亡而發(fā)揮抗腫瘤活性，這些結(jié)果也表明重組表達(dá)的PTA-N具有與天然PTA相似的生理功能。本研究根據(jù)PTA晶體結(jié)構(gòu)信息，通過堿性磷酸酶信號(hào)肽與目的蛋白融合，構(gòu)建分泌表達(dá)體系，實(shí)