蛋白質(zhì)的表達純化、晶體分析和活性研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個錯綜復(fù)雜且高度有序的動態(tài)過程，必須借由一套精密調(diào)控系統(tǒng)即差異表達基因來保證這個復(fù)雜過程的精確性。因此，分離、克隆不同發(fā)育階段的差異表達基因，并通過各種功能實驗深入研究它們調(diào)控精子發(fā)生的過程，將對精子發(fā)生機理的闡明起到重大的推動作用，同時也將對人類的生殖健康做出巨大貢獻。
　　 結(jié)構(gòu)生物學(xué)是發(fā)展日新月異的一門學(xué)科。即通過純化蛋白質(zhì)、篩選和優(yōu)化晶體、X射線衍射（或其他技術(shù)）等手段獲得蛋白質(zhì)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)并對其三級結(jié)構(gòu)進行

2、解析。結(jié)構(gòu)信息的獲得常會帶來功能研究上的提示與突破，因此在研究中將結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)合起來是目前科研的趨勢。
　　 本論文研究即包含以上關(guān)注的兩個方面，研究內(nèi)容分為兩部分，分別介紹如下：
　　 第一部分：RSA-14-44和相關(guān)蛋白質(zhì)的純化及其GTPase活性測定
　　 在本實驗室的前期工作中，我們利用激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser CaptureMicrodissection，LCM）和抑制性消減雜交技術(shù)（Supp

3、ressive Substractive Hybridization，SSH）成功地捕獲了大鼠生精過程中的初級精母細胞和圓形精子細胞，并構(gòu)建成功了圓形精子細胞消減初級精母細胞的消減cDNA文庫（RSA），進而從中篩選出差異表達基因。本研究中所涉及的RSA-14-44/mRSA-14-44就是通過上述篩選所得到的一個新基因。該基因在GenBank中的登錄號為AY149343，編碼序列長度為582bp，編碼一個由193個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

4、經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)中具有Rho-GTPase保守結(jié)構(gòu)域。
　　 生物信息學(xué)分析結(jié)果同時顯示，RSA-14-44的氨基酸序列與Rho GTPase家族中的RhoA like亞家族成員高度同源。在本部分工作中，我們純化出了GST-RSA-14-44蛋白，并通過實驗證明該蛋白具有GTPase活性，因此確定RSA-14-44是RhoA like亞家族的一個新成員。同時，我們還純化了RSA-14-44的截短體及其他相關(guān)蛋白質(zhì)并

5、進行研究，以期發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的其他重要功能。
　　 因為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的相關(guān)研究手段如克隆構(gòu)建、表達純化等技術(shù)已比較成熟，我們還利用該平臺純化了Jab1、Smad3等蛋白，有效的推動了這些蛋白質(zhì)的功能研究工作。
　　 第二部分：騰沖嗜熱厭氧菌新型半乳糖變旋酶TTE1925的表達純化及晶體分析
　　 新型半乳糖變旋酶（tte1925）基因是錢忠等（北京基因組研究所）利用生物信息學(xué)分析結(jié)合生物化學(xué)實驗，在騰沖嗜熱厭氧菌（T

6、hermoanaerobacter tengcongensis，T。tengcongensis）半乳糖操縱子中發(fā)現(xiàn)的一個功能尚未注釋的基因（hypothetical protein），該蛋白質(zhì)在GenBank的序列號為NP_623500，開放閱讀框編碼301個氨基酸，通過生物信息學(xué)分析，TTE1925被初步定義為半乳糖變旋酶（GalM）。隨后利用旋光儀實驗，TTE1925被生物學(xué)鑒定為半乳糖變旋酶。但是由于其在氨基酸序列上的高度變異性，

7、與目前已知的半乳糖變旋酶在序列上不具有同源性?；谠摰鞍踪|(zhì)的特殊性，本研究通過將tte1925基因克隆至原核表達載體pGEX-6P-1中，將菌落PCR和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）后獲得表達菌株。該菌株經(jīng)異丙基-13-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)高效表達出帶有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）標簽的可溶性融合蛋白，經(jīng)過GlutathioneSepharoseTM4B親和層析、Resource Q6mL離子交換層