蛋白質(zhì)表達(dá)、純化與晶體結(jié)構(gòu).pdf

1、第1章非出血活性的五步蛇毒鋅金屬蛋白酶FII與其內(nèi)源性三肽抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究 P-I類蛇毒金屬蛋白酶可以直接水解纖維蛋白/纖維蛋白原，因而可作為潛在的溶栓藥。但是這類酶同時(shí)還可水解血管基底膜蛋白，因此可能導(dǎo)致出血副反應(yīng)。為了更好地了解來源于五步蛇蛇毒的鋅金屬蛋白酶FII的作用機(jī)制，為對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其藥理作用的特異性并減少副反應(yīng)提供結(jié)構(gòu)方面的信息，我們采用汽相擴(kuò)散懸滴法制備FII蛋白晶體，并對(duì)該晶體進(jìn)行X-射線衍射

2、分析，得到了FII蛋白的1.9 A分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)該酶分子由兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，并含兩個(gè)高度保守的特征性序列：鋅結(jié)合序列H<,142>E<,143>XXH<,146>XXGXXH<,152>和Met—turn：C<,163>Ⅰ<,164>M<,165>。其中N-端結(jié)構(gòu)域占了蛋白全長(zhǎng)的大約3/4，是一個(gè)典型的a/β結(jié)構(gòu)。4個(gè)a螺旋圍繞著四個(gè)平行的和一個(gè)反平行的β片層。C-端結(jié)構(gòu)域包含了一個(gè)長(zhǎng)的a螺旋和Met-turn。蛋白水解活性

3、必需的鋅離子位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的間隙中，并與高度保守序列H<,142>E<,143>XXH<,146>XXGXXH<,152在>中三個(gè)組氨酸殘基的Nε2氮原子和一個(gè)水分子螯合。在電子密度圖上還清晰地看到在活性中心周圍有一個(gè)三肽，其序列為L(zhǎng)ys—Asn—Leu(KNL)，通過一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一三肽對(duì)FII的活性有抑制作用。 我們實(shí)驗(yàn)室在畢赤酵母中成功地表達(dá)了來源于Agkistrodon acutus的無出血活性的P-

4、I類重組蛇毒金屬蛋白酶rFII，并發(fā)現(xiàn)它對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓動(dòng)物模型有良好的溶栓作用。但在高劑量時(shí)，rFII還可以降解血管基底膜蛋白，因此存在潛在的出血副反應(yīng)。我們?cè)?jīng)嘗試使用畢赤酵母表達(dá)的rFII進(jìn)行結(jié)晶，希望通過晶體結(jié)構(gòu)來解釋其作用機(jī)理，并利用結(jié)構(gòu)信息來對(duì)其進(jìn)行改造，增加對(duì)作用底物的選擇性，以減少臨床應(yīng)用的副反應(yīng)。然而，始終未能得到晶體。推測(cè)其原因可能是酵母表達(dá)的異源蛋白存在不均一的翻譯后修飾所致。大腸桿菌Escherichia col

5、i(E.coli)是目前常用的另一個(gè)表達(dá)異源蛋白的宿主，具有不對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)，迄今為止大部分成功得到晶體結(jié)構(gòu)的重組蛋白都是E.coli表達(dá)。因此我們重新將多個(gè)片斷長(zhǎng)度的rFII基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pETl5b、pET32a及pMAL c2x和pMAL p2x上，在大腸桿菌菌株BL2l(codonplus)和／或Origami B中過表達(dá)。并采用親和層析、離子交換層析和分子篩層析純化“可溶性蛋白”，或采用尿素或鹽

6、酸胍從包涵體中變性并純化重組蛋白，采用稀釋、親和柱輔助的手段使變性蛋白復(fù)性。未能得到可溶性有活性的rFII蛋白。 第3章 芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子2(ARNT2)在大腸桿菌的克隆、表達(dá)和純化bHLH/PAS蛋白超家族(basic Helix-Loop-Helix Per-Arnt-Sim proteins)是在許多重要生理和發(fā)育過程基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。ARNT2被認(rèn)為是bHLH/PAS蛋白家族成員中的通用型配基，主要在中樞

7、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟表達(dá)，可與HIF-Iα結(jié)合形成二聚體，發(fā)揮調(diào)控缺氧應(yīng)答的功能。ARNT2和SIM蛋白形成的二聚體可以調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌軸的發(fā)育進(jìn)程。為了了解ARNT2在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的分子機(jī)制，我們?cè)贓.coli克隆、表達(dá)和純化了大鼠ARNT2(330-711)，但是未能得到晶體。 第4章 PDE9A(催化結(jié)構(gòu)域)在大腸桿菌的表達(dá)、純化及初步的晶體學(xué)研究環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)可以通過

8、降解環(huán)核苷酸(cAMP，caMP)而控制其在細(xì)胞內(nèi)的濃度，從而影響多種生理過程。深入了解PDEs對(duì)環(huán)核苷酸底物特異性和抑制劑選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可以幫助設(shè)計(jì)效應(yīng)更強(qiáng)、副作用更少的PDE抑制劑。我們從大腸桿菌菌株BL21(codonplus)表達(dá)并純化了野生型和突變性PDE9A(催化結(jié)構(gòu)域)，并得到了未結(jié)合配基的PDE9A、PDE9A和其水解產(chǎn)物GMP、PDE9A和非選擇性抑制劑theophyline復(fù)合物以及兩個(gè)PDE9A突變體和底物cGM