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![2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-7/6/20/f73868a3-97d4-491c-862d-21f4f8873921/f73868a3-97d4-491c-862d-21f4f88739211.gif)
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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)分離純化與檢測技術(shù),聚丙烯酰胺凝膠電泳,PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑亞甲雙丙烯酰胺(Bis) 在加速劑N,N,N?,N?—四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)或核黃素(C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠聚合時(shí)所形成的微孔影響了不同分子的遷移率,當(dāng)施加一定電壓時(shí)小分子的物質(zhì)的遷移速率將快于大分子的物質(zhì)
2、,即所謂的分子篩效應(yīng)。,聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,,,消除蛋白質(zhì)分子形狀的影響,掩蓋不同類蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別,,,聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中,蛋白樣品與上樣緩沖液混合變性,上樣緩沖液中含有SDS和巰基乙醇使得蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原,氫鍵、疏水鍵打開,SDS按1.4g SDS/1g蛋白質(zhì)的比例結(jié)合到蛋白質(zhì)多肽鏈分子上,形成SDS-多肽復(fù)合物。由于十二烷基磺酸根帶負(fù)電,SDS覆蓋于蛋白質(zhì)的表面,破壞了蛋白質(zhì)
3、分子的四級結(jié)構(gòu)而使多肽復(fù)合物具有近似的形狀(長橢圓棒狀),并且復(fù)合物所帶有的負(fù)電荷大大超過了多肽分子原有的電荷量,因而掩蓋了多肽分子原有的電荷差別。,,聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,如圖所示,蛋白質(zhì)所帶的電性主要取決于氨基酸R集團(tuán)所帶的電性。圖中的H代表無極性的R集團(tuán)為了躲避水而聚集于內(nèi)部。 當(dāng)SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)多肽鏈分子上,形成SDS-多肽復(fù)合物后, SDS均勻覆蓋于蛋白質(zhì)的表面,破壞蛋白質(zhì)分子的疏水作用而成為線性分子。,,SDS- 聚丙烯
4、酰胺凝膠使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中,一般凝膠分為低濃度的成層膠(濃縮膠)和較高濃度的分離膠。在電泳時(shí), SDS-多肽復(fù)合物向兩膠界面遷移,在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層,極大地濃縮了樣品的體積,使樣品在分離之前處于同一起跑線。,試劑,30%凝膠貯備液: 含29%(W/V)丙烯酰胺 1% (W/V)N,N-亞甲雙丙烯酰胺10%SDSTEMED(N
5、,N,N′,N ′-四甲基乙烯二胺)10%過硫酸胺Tris- 甘氨酸電泳緩沖液: 25mmol/L Tris 250mmol/L甘氨酸(pH8.3) 0.1%SDS1.5mol/L Tris?C
6、l(pH8.8) 分離膠1.0mol/L Tris?Cl(pH6.8) 濃縮膠,表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) ?104 20-30 1-4×104 15-2
7、0 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104
8、 15-20 104-105 5-10 105-2×106 2-2.6,,,,,,蛋白質(zhì)的分離純化,Invitrogen ProbondTM Purification System,分離純化原理,金屬螯合層析:在瓊脂糖上偶聯(lián)了螯合劑亞氨基二乙酸(IDA)鈉。IDA的鈉鹽與金屬離
9、子如Ni++螯合后,可與生物分子如蛋白質(zhì)結(jié)合,不同的蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合力不同,從而將蛋白質(zhì)分離。 ProBond?是一種帶有正電荷鎳離子的瓊脂糖樹脂,帶有6×His標(biāo)簽的蛋白與固定在ProBond?上的二價(jià)鎳離子具有高度的親和性,用某種與吸附蛋白質(zhì)競爭結(jié)合的溶質(zhì)洗脫親和基質(zhì),特異性地將吸附的各種蛋白質(zhì)分別洗脫下來。這類溶質(zhì)包括含-NH2、-COOH、-SH等基團(tuán)的物質(zhì)和咪唑等取代劑。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
10、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,帶有His?Tag 蛋白質(zhì)分子,分離純化原理,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,咪唑,,,,分離純化原理,操作流程,一、柱子的制備二、蛋白的純化,一、柱子的制備,將裝有樹脂的瓶子不斷的顛倒輕敲,使樹脂在瓶中重懸。吸取2ml樹脂加入純化柱中,靜置5-10分鐘,通過重力使樹脂沉淀在柱底;也可以通過低速離心(800×g,1min)的方法使樹脂沉淀在柱底
11、, 輕輕吸去上清液。吸取6ml無菌蒸餾水加入柱中,不斷的顛倒輕敲,使樹脂在柱中重懸。重復(fù)步驟2。在柱子中加入6mL Native Binding Buffer。不斷的顛倒輕敲,使樹脂在柱中重懸。重復(fù)步驟2。重復(fù)步驟5-7。,二、蛋白的純化,吸取8ml溶解產(chǎn)物加入已經(jīng)制備好的純化柱中。輕輕滾柱子動(dòng)使樹脂在溶解產(chǎn)物中保持懸浮狀態(tài),使帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白與樹脂充分結(jié)合,此過程30-60min。通過重力或低速離心(800
12、5;g)的方法使樹脂沉淀在柱底,輕輕吸去上清夜,上清液于4℃儲存并做SDS-PAGE分析。用8ml Native Wash Binding洗滌,通過重力或低速離心(800×g)的方法使樹脂沉淀在柱底,輕輕吸去上清夜,上清液于4℃儲存并做SDS-PAGE分析。重復(fù)步驟4三次以上。夾緊柱子,使柱子與地面保持垂直,將柱子底端的帽折斷,用8-12ml的Native Elution Buffer洗脫蛋白,收集洗脫液,并取少量做SD
13、S-PAGE分析。,抗體的制備,佐劑,佐劑:延長抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間,增加抗原刺激作用,更主要的是,它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多,促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用,從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是福氏佐劑(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份,羊毛脂與石臘油的比例,視需要可調(diào)整為1:2~9(V/V),這是不完全福氏佐劑,在每毫升不完全佐劑加入1~20mg卡介苗
14、就成為完全佐劑。,效價(jià),定 義:抗血清的效價(jià),就是指血清中所含抗體的濃 度或含量。測定方法:雙向瓊脂糖擴(kuò)散、ELISA等方法測定。,抗體制備過程,制備純凈的抗原測定抗原濃度,>0.5mg/mL??乖米魟┤榛话愠S闷は禄虮巢慷帱c(diǎn)皮內(nèi)注射,首次劑量為300~500μg,使用完全佐劑。加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2~3周加強(qiáng)免疫一次,加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑。在第2次加
15、強(qiáng)免疫后2周,從耳緣靜脈取2~3ml,制備血清,檢測抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià),需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫,直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí),即可放血制備抗血清。,血清的采集,收集的血液置于室溫下1h左右,凝固后,置4℃下,過夜(切勿冰凍)析出血清,離心,4000rpm,10min。在無菌條件,吸出血清,分裝(0.05~0.2mL),貯于-40℃以下冰箱,或凍干后貯存于4℃冰箱保存。,雙向瓊脂板擴(kuò)散免疫試驗(yàn),雙向瓊脂板擴(kuò)散免疫試驗(yàn)又稱雙向
16、免疫擴(kuò)散試驗(yàn),將抗原和相應(yīng)的抗體分別加入同一凝膠板的相鄰小孔中,使兩者相互擴(kuò)散,當(dāng)擴(kuò)散到它們比例合適的部位時(shí),就會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀,在瓊脂中呈現(xiàn)一條乳白色的沉淀線。故此試驗(yàn)可用已知抗原檢測未知抗體。由于沉淀線形成的位置與抗原、抗體的濃度相關(guān),抗原濃度越濃,形成的沉淀線距離抗原孔越遠(yuǎn),同樣,抗體濃度越濃,形成的沉淀線距離抗體孔越遠(yuǎn)。據(jù)此,固定抗原濃度,稀釋抗體,可測定抗體效價(jià)。,雙向瓊脂板擴(kuò)散免疫試驗(yàn),配制1.5%生理鹽水瓊脂:
17、100mL生理鹽水中加入1.5g優(yōu)質(zhì)瓊脂粉,置水浴中融化后,加入硫柳汞濃度為0.01%以防腐,分裝于小試管中,每管3mL,置于冰箱保存?zhèn)溆?;將盛?mL生理鹽水瓊脂的小試管置水浴中融化;將融化好的瓊脂傾注于載玻片上,每管鋪一板,厚度為1mm,共鋪3塊板;瓊脂凝固后,按模板打孔,中心孔為抗原孔,四周8個(gè)孔為抗體孔,孔徑3mm,孔距4mm。打孔后將載玻片于酒精燈上烘烤背面(溫度不宜過高,以不燙手為宜),使瓊脂與玻片貼緊;,瓊脂板雙向擴(kuò)
18、散免疫實(shí)驗(yàn),將從兔中采得的血清按二倍稀釋法稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的不同濃度,同時(shí)也將抗原按二倍稀釋法稀釋成1:2、1:4、1:16;將已經(jīng)稀釋好的抗體按一定的順序加入到四周孔中,其中一孔滴入生理鹽水以做對照(均以滴滿不溢出為度或用微量加樣器定量加入),中心孔中加入抗原,將已經(jīng)稀釋好的抗原分別滴入3塊板的中心孔中;放入濕盒內(nèi),置37℃經(jīng)24小時(shí)觀察沉淀線出現(xiàn)的情況,記錄結(jié)果。以出現(xiàn)明顯的沉淀線的最高稀釋度為該
19、抗體的效價(jià)。,兔抗血清效價(jià)檢測a、b、c板中心孔為純化的抗原SCMRP,稀釋倍數(shù)分別是0、1/4、1/16;四周孔為制備的抗血清梯度稀釋液和對照,孔1為生理鹽水,孔2-7為抗血清0、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀釋液,孔8為空白;d板為免疫的1號新西蘭大耳兔。 Detection of the rabbit antiserum valuethe center of a, b, c plate is the puri
20、fication antigen, respectively dilute in the proportion 0, 1/4, 1/16; the around hole is filled with a serial antiserum diluted in grads and the blank hole; hole 1: isotonic Na chloride, hole 2-7: antiserum respectively
21、dilute in the proportion 0, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; hole8: blank picture; d: immune New Zealand long ear rabbit.,,兔抗血清效價(jià)測定,Western Blot,,Western Blot原理,Western Blot 印跡常用轉(zhuǎn)移膜及其特點(diǎn),,電轉(zhuǎn)移流程,配制電轉(zhuǎn)移緩沖液,4℃預(yù)冷。將膜與濾紙切成與膠同樣的大小。
22、 注: 通常情況下長寬各比膠小1mm; 切一個(gè)小小的角以標(biāo)識正反面和上下。將膜、濾紙與海綿墊在電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min-1h 注:PVDF膜在使用前先用100%甲醇浸泡15 s,然后 用去離子水浸泡2min。壓膜?電轉(zhuǎn)移?膜固定:干燥(37℃干燥1h)膜重新濕潤:先用100%甲醇浸泡15 s,然后用去離子水浸泡2min,電轉(zhuǎn)移
23、流程?,轉(zhuǎn)膜條件?,標(biāo)記,將膜在室溫下用封閉試劑封閉20-60分鐘,期間不斷搖動(dòng),如要得到最佳結(jié)果,需在室溫下封閉1小時(shí)。移去封閉劑,加上適當(dāng)?shù)某跫壙贵w稀釋液,在不斷搖動(dòng)下雜交1小時(shí)。如果需要,與初級抗體的預(yù)雜交可在2-8℃搖動(dòng)過夜。洗滌雜交膜,時(shí)間≥5分鐘,此過程重復(fù)4-6次,移去洗滌緩沖液。加入二抗(辣根過氧化物酶復(fù)合物),在不斷搖動(dòng)下雜交1小時(shí)。洗滌雜交膜,時(shí)間≥5分鐘,此過程重復(fù)4-6次,移去洗滌緩沖。重復(fù)過程3以除去
24、沒有結(jié)合上的辣根過氧化物酶復(fù)合物。,顯影,工作液的制備:可以可以把過氧化物溶液與發(fā)光氨(氨基苯 二酰一肼)以等體積混合。每平方厘米膜使用0.125ml工作液,工作液可以在室溫下穩(wěn)定貯藏8小時(shí)。注:暴露于日光或其它強(qiáng)光下可以損壞工作液,為了得到最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果工作液應(yīng)貯存在棕色瓶中,避免長時(shí)間暴露于任何強(qiáng)光下。膜與工作液雜交5分鐘。將雜交膜從工作液中移出,放入一塑料膜保護(hù)器中:塑料薄膜或塑料包裝。用吸水組織移去多余液體,仔細(xì)排出膜雜交
25、與塑料保護(hù)器之間的氣泡。將膜保護(hù)器放入暗盒中,有蛋白質(zhì)的一面要朝上,關(guān)閉所有的燈除了那些適合于膠片曝光的光線(如,紅外線)。小心將膠片放在膜上。建議第一次曝光時(shí)間是60s,為了得到最佳結(jié)果應(yīng)優(yōu)化曝光時(shí)間,增強(qiáng)放射能照像光強(qiáng)是沒有必要的,在膠片曝光之前應(yīng)避免提前的放射能照像閃光。,注意事項(xiàng),不要直接用手直接接觸雜交膜,應(yīng)該戴手套或用干凈的鑷子。上樣不應(yīng)過多。濾紙和膜的長和寬都要比膠小1mm,避免短路。膜要標(biāo)記好正反面,在感光時(shí)要
26、用膜的正面與膠片相貼。壓膜時(shí)膜與膠之間、膜與濾紙間、膠與濾紙之間要避免有氣泡產(chǎn)生;感光時(shí),膜與膠片之間都要避免有氣泡產(chǎn)生。膜用工作液處理后,應(yīng)立即在暗室中使膠片感光。初級抗體的稀釋到0.2-1.0μg/ml或由1mg/ml的母液按1:1,000~1:5,000稀釋??乖贵w的量需要優(yōu)化,次級抗體的稀釋到10-50ng/ml或由1mg/ml的母液按1:20,000-1:100,000稀釋。預(yù)先統(tǒng)計(jì)好所用藥品的量;新配制的藥品不要
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