蛋白質(zhì)分離純化與檢測技術(shù)

1、蛋白質(zhì)分離純化與檢測技術(shù),聚丙烯酰胺凝膠電泳,PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑亞甲雙丙烯酰胺(Bis) 在加速劑N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)或核黃素(C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠聚合時(shí)所形成的微孔影響了不同分子的遷移率，當(dāng)施加一定電壓時(shí)小分子的物質(zhì)的遷移速率將快于大分子的物質(zhì)

2、，即所謂的分子篩效應(yīng)。,聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,,,消除蛋白質(zhì)分子形狀的影響,掩蓋不同類蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別,,,聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白樣品與上樣緩沖液混合變性，上樣緩沖液中含有SDS和巰基乙醇使得蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，氫鍵、疏水鍵打開，SDS按1.4g SDS/1g蛋白質(zhì)的比例結(jié)合到蛋白質(zhì)多肽鏈分子上，形成SDS-多肽復(fù)合物。由于十二烷基磺酸根帶負(fù)電，SDS覆蓋于蛋白質(zhì)的表面，破壞了蛋白質(zhì)

3、分子的四級結(jié)構(gòu)而使多肽復(fù)合物具有近似的形狀（長橢圓棒狀），并且復(fù)合物所帶有的負(fù)電荷大大超過了多肽分子原有的電荷量，因而掩蓋了多肽分子原有的電荷差別。,,聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,如圖所示，蛋白質(zhì)所帶的電性主要取決于氨基酸R集團(tuán)所帶的電性。圖中的H代表無極性的R集團(tuán)為了躲避水而聚集于內(nèi)部。 當(dāng)SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)多肽鏈分子上，形成SDS-多肽復(fù)合物后， SDS均勻覆蓋于蛋白質(zhì)的表面，破壞蛋白質(zhì)分子的疏水作用而成為線性分子。,,SDS- 聚丙烯

4、酰胺凝膠使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，一般凝膠分為低濃度的成層膠（濃縮膠）和較高濃度的分離膠。在電泳時(shí)， SDS-多肽復(fù)合物向兩膠界面遷移，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層，極大地濃縮了樣品的體積，使樣品在分離之前處于同一起跑線。,試劑,30%凝膠貯備液： 含29%（W/V）丙烯酰胺 1% （W/V）N，N-亞甲雙丙烯酰胺10%SDSTEMED（N

5、，N，N′，N ′-四甲基乙烯二胺）10%過硫酸胺Tris- 甘氨酸電泳緩沖液： 25mmol/L Tris 250mmol/L甘氨酸（pH8.3） 0.1%SDS1.5mol/L Tris?C

6、l(pH8.8) 分離膠1.0mol/L Tris?Cl(pH6.8) 濃縮膠,表3.4 分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) ?104 20-30 1-4×104 15-2

7、0 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104

8、 15-20 104-105 5-10 105-2×106 2-2.6,,,,,,蛋白質(zhì)的分離純化,Invitrogen ProbondTM Purification System,分離純化原理,金屬螯合層析：在瓊脂糖上偶聯(lián)了螯合劑亞氨基二乙酸(IDA)鈉。IDA的鈉鹽與金屬離

9、子如Ni++螯合后，可與生物分子如蛋白質(zhì)結(jié)合，不同的蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合力不同，從而將蛋白質(zhì)分離。 ProBond?是一種帶有正電荷鎳離子的瓊脂糖樹脂，帶有6×His標(biāo)簽的蛋白與固定在ProBond?上的二價(jià)鎳離子具有高度的親和性，用某種與吸附蛋白質(zhì)競爭結(jié)合的溶質(zhì)洗脫親和基質(zhì)，特異性地將吸附的各種蛋白質(zhì)分別洗脫下來。這類溶質(zhì)包括含-NH2、-COOH、-SH等基團(tuán)的物質(zhì)和咪唑等取代劑。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

10、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,帶有His?Tag 蛋白質(zhì)分子,分離純化原理,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,咪唑,,,,分離純化原理,操作流程,一、柱子的制備二、蛋白的純化,一、柱子的制備,將裝有樹脂的瓶子不斷的顛倒輕敲，使樹脂在瓶中重懸。吸取2ml樹脂加入純化柱中，靜置5-10分鐘，通過重力使樹脂沉淀在柱底；也可以通過低速離心（800×g,1min）的方法使樹脂沉淀在柱底

11、, 輕輕吸去上清液。吸取6ml無菌蒸餾水加入柱中，不斷的顛倒輕敲，使樹脂在柱中重懸。重復(fù)步驟2。在柱子中加入6mL Native Binding Buffer。不斷的顛倒輕敲，使樹脂在柱中重懸。重復(fù)步驟2。重復(fù)步驟5-7。,二、蛋白的純化,吸取8ml溶解產(chǎn)物加入已經(jīng)制備好的純化柱中。輕輕滾柱子動(dòng)使樹脂在溶解產(chǎn)物中保持懸浮狀態(tài)，使帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白與樹脂充分結(jié)合，此過程30-60min。通過重力或低速離心（800

12、5;g）的方法使樹脂沉淀在柱底，輕輕吸去上清夜,上清液于4℃儲存并做SDS-PAGE分析。用8ml Native Wash Binding洗滌，通過重力或低速離心（800×g）的方法使樹脂沉淀在柱底，輕輕吸去上清夜,上清液于4℃儲存并做SDS-PAGE分析。重復(fù)步驟4三次以上。夾緊柱子，使柱子與地面保持垂直，將柱子底端的帽折斷，用8-12ml的Native Elution Buffer洗脫蛋白，收集洗脫液，并取少量做SD

13、S-PAGE分析。,抗體的制備,佐劑,佐劑：延長抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗

14、就成為完全佐劑。,效價(jià),定 義：抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃 度或含量。測定方法：雙向瓊脂糖擴(kuò)散、ELISA等方法測定。,抗體制備過程,制備純凈的抗原測定抗原濃度，＞0.5mg/mL?？乖米魟┤榛话愠Ｓ闷は禄虮巢慷帱c(diǎn)皮內(nèi)注射，首次劑量為300～500μg，使用完全佐劑。加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑。在第2次加

15、強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml，制備血清，檢測抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。,血清的采集,收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm，10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2mL），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4℃冰箱保存。,雙向瓊脂板擴(kuò)散免疫試驗(yàn),雙向瓊脂板擴(kuò)散免疫試驗(yàn)又稱雙向

16、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，將抗原和相應(yīng)的抗體分別加入同一凝膠板的相鄰小孔中，使兩者相互擴(kuò)散，當(dāng)擴(kuò)散到它們比例合適的部位時(shí)，就會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀，在瓊脂中呈現(xiàn)一條乳白色的沉淀線。故此試驗(yàn)可用已知抗原檢測未知抗體。由于沉淀線形成的位置與抗原、抗體的濃度相關(guān)，抗原濃度越濃，形成的沉淀線距離抗原孔越遠(yuǎn)，同樣，抗體濃度越濃，形成的沉淀線距離抗體孔越遠(yuǎn)。據(jù)此，固定抗原濃度，稀釋抗體，可測定抗體效價(jià)。,雙向瓊脂板擴(kuò)散免疫試驗(yàn),配制1.5%生理鹽水瓊脂：

17、100mL生理鹽水中加入1.5g優(yōu)質(zhì)瓊脂粉，置水浴中融化后，加入硫柳汞濃度為0.01%以防腐，分裝于小試管中，每管3mL，置于冰箱保存?zhèn)溆?；將盛?mL生理鹽水瓊脂的小試管置水浴中融化；將融化好的瓊脂傾注于載玻片上，每管鋪一板，厚度為1mm，共鋪3塊板；瓊脂凝固后，按模板打孔，中心孔為抗原孔，四周8個(gè)孔為抗體孔，孔徑3mm，孔距4mm。打孔后將載玻片于酒精燈上烘烤背面（溫度不宜過高，以不燙手為宜），使瓊脂與玻片貼緊；,瓊脂板雙向擴(kuò)

18、散免疫實(shí)驗(yàn),將從兔中采得的血清按二倍稀釋法稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的不同濃度，同時(shí)也將抗原按二倍稀釋法稀釋成1:2、1:4、1:16；將已經(jīng)稀釋好的抗體按一定的順序加入到四周孔中，其中一孔滴入生理鹽水以做對照（均以滴滿不溢出為度或用微量加樣器定量加入），中心孔中加入抗原，將已經(jīng)稀釋好的抗原分別滴入3塊板的中心孔中；放入濕盒內(nèi)，置37℃經(jīng)24小時(shí)觀察沉淀線出現(xiàn)的情況，記錄結(jié)果。以出現(xiàn)明顯的沉淀線的最高稀釋度為該

19、抗體的效價(jià)。,兔抗血清效價(jià)檢測a、b、c板中心孔為純化的抗原SCMRP，稀釋倍數(shù)分別是0、1/4、1/16；四周孔為制備的抗血清梯度稀釋液和對照，孔1為生理鹽水，孔2-7為抗血清0、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀釋液，孔8為空白；d板為免疫的1號新西蘭大耳兔。 Detection of the rabbit antiserum valuethe center of a, b, c plate is the puri

20、fication antigen, respectively dilute in the proportion 0, 1/4, 1/16; the around hole is filled with a serial antiserum diluted in grads and the blank hole; hole 1: isotonic Na chloride, hole 2-7: antiserum respectively

21、dilute in the proportion 0, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; hole8: blank picture; d: immune New Zealand long ear rabbit.,,兔抗血清效價(jià)測定,Western Blot,,Western Blot原理,Western Blot 印跡常用轉(zhuǎn)移膜及其特點(diǎn),,電轉(zhuǎn)移流程,配制電轉(zhuǎn)移緩沖液，4℃預(yù)冷。將膜與濾紙切成與膠同樣的大小。

22、 注： 通常情況下長寬各比膠小1mm； 切一個(gè)小小的角以標(biāo)識正反面和上下。將膜、濾紙與海綿墊在電轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min-1h 注：PVDF膜在使用前先用100%甲醇浸泡15 s，然后 用去離子水浸泡2min。壓膜?電轉(zhuǎn)移?膜固定：干燥（37℃干燥１h）膜重新濕潤：先用100%甲醇浸泡15 s，然后用去離子水浸泡2min,電轉(zhuǎn)移

23、流程?,轉(zhuǎn)膜條件?,標(biāo)記,將膜在室溫下用封閉試劑封閉20-60分鐘，期間不斷搖動(dòng)，如要得到最佳結(jié)果，需在室溫下封閉1小時(shí)。移去封閉劑，加上適當(dāng)?shù)某跫壙贵w稀釋液，在不斷搖動(dòng)下雜交1小時(shí)。如果需要，與初級抗體的預(yù)雜交可在2-8℃搖動(dòng)過夜。洗滌雜交膜，時(shí)間≥5分鐘，此過程重復(fù)4-6次，移去洗滌緩沖液。加入二抗(辣根過氧化物酶復(fù)合物)，在不斷搖動(dòng)下雜交1小時(shí)。洗滌雜交膜，時(shí)間≥5分鐘，此過程重復(fù)4-6次，移去洗滌緩沖。重復(fù)過程3以除去

24、沒有結(jié)合上的辣根過氧化物酶復(fù)合物。,顯影,工作液的制備：可以可以把過氧化物溶液與發(fā)光氨（氨基苯 二酰一肼）以等體積混合。每平方厘米膜使用0.125ml工作液，工作液可以在室溫下穩(wěn)定貯藏8小時(shí)。注：暴露于日光或其它強(qiáng)光下可以損壞工作液，為了得到最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果工作液應(yīng)貯存在棕色瓶中，避免長時(shí)間暴露于任何強(qiáng)光下。膜與工作液雜交5分鐘。將雜交膜從工作液中移出，放入一塑料膜保護(hù)器中：塑料薄膜或塑料包裝。用吸水組織移去多余液體，仔細(xì)排出膜雜交

25、與塑料保護(hù)器之間的氣泡。將膜保護(hù)器放入暗盒中，有蛋白質(zhì)的一面要朝上，關(guān)閉所有的燈除了那些適合于膠片曝光的光線（如，紅外線）。小心將膠片放在膜上。建議第一次曝光時(shí)間是60s，為了得到最佳結(jié)果應(yīng)優(yōu)化曝光時(shí)間，增強(qiáng)放射能照像光強(qiáng)是沒有必要的，在膠片曝光之前應(yīng)避免提前的放射能照像閃光。,注意事項(xiàng),不要直接用手直接接觸雜交膜，應(yīng)該戴手套或用干凈的鑷子。上樣不應(yīng)過多。濾紙和膜的長和寬都要比膠小1mm，避免短路。膜要標(biāo)記好正反面，在感光時(shí)要

26、用膜的正面與膠片相貼。壓膜時(shí)膜與膠之間、膜與濾紙間、膠與濾紙之間要避免有氣泡產(chǎn)生；感光時(shí)，膜與膠片之間都要避免有氣泡產(chǎn)生。膜用工作液處理后，應(yīng)立即在暗室中使膠片感光。初級抗體的稀釋到0.2-1.0μg/ml或由1mg/ml的母液按1：1，000~1：5，000稀釋?？乖贵w的量需要優(yōu)化，次級抗體的稀釋到10-50ng/ml或由1mg/ml的母液按1：20，000-1：100，000稀釋。預(yù)先統(tǒng)計(jì)好所用藥品的量；新配制的藥品不要