蛋白質(zhì)純化制備工藝研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)就是蛋白質(zhì)純化。轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)是血漿中的一種微量蛋白，在人血漿中的濃度為2.5 g/L左右。Tf具有許多重要的功能，例如抗菌作用、轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子，還可以作為細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，在癌癥的治療領(lǐng)域也有著重要的研究?jī)r(jià)值。本文以Tf為目標(biāo)蛋白，建立了一種從Cohn血漿分離法的廢棄產(chǎn)物組分Ⅳ中純化Tf的兩步層析方法，對(duì)得到的Tf產(chǎn)品進(jìn)行了表征及活性鑒定，并在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行了中試放大。
　　首先介

2、紹了蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(A)KTA explorer100的組成、操作以及工作流程，為后續(xù)的蛋白質(zhì)純化工作奠定基礎(chǔ)。
　　其次研究從Cohn組分Ⅳ中純化Tf的兩步層析工藝。組分Ⅳ的預(yù)處理過程中發(fā)現(xiàn)，Tris-HCl緩沖液不利于組分Ⅳ的離心，影響后續(xù)的過濾，因此選擇了將組分Ⅳ溶解于超純水。根據(jù)Tf的等電點(diǎn)、疏水性與雜質(zhì)蛋白的差異，選取了離子交換層析結(jié)合疏水層析的純化方案。比較了離子交換層析過程中的層析介質(zhì)以及pH兩個(gè)重要因素的影響效果，

3、發(fā)現(xiàn)Capto DEAE層析介質(zhì)以及pH7.0條件下的分離效果較好，得到的Tf純度高、收率好、純化速度快，適合進(jìn)行初步分離。疏水層析過程中選取了鹽濃度作為考察因素，比較了四種不同鹽濃度下的分離效果，發(fā)現(xiàn)硫酸銨濃度為1.0 mol/L時(shí)目標(biāo)蛋白的收率和純度都取得了不錯(cuò)的效果。
　　然后對(duì)Tf樣品進(jìn)行了表征及活性鑒定。通過凝膠過濾高效液相色譜(HPSEC)檢測(cè)Tf的結(jié)構(gòu)完整性及是否存在聚集體;圓二色光譜鑒定結(jié)果表明Tf的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)

4、生改變;通過質(zhì)譜檢測(cè)其分子量為78726;全波長(zhǎng)掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)在465nm處有明顯的特征吸收峰，表明Tf能結(jié)合兩個(gè)鐵離子;抗菌活性測(cè)定結(jié)果表明Tf對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
　　最后在最優(yōu)層析條件下進(jìn)行了Tf的純化中試，每批次得到了1 g左右的Tf樣品。Tf的純度都達(dá)到了99％以上，并且收率較實(shí)驗(yàn)階段有所提高達(dá)到了80％以上。
　　本文建立了新型的Tf兩步層析純化工藝，該工藝收率好、純度高、適合工業(yè)放大，同時(shí)將廢棄組分