蛋白質(zhì)復(fù)性助劑設(shè)計與同電荷介質(zhì)促進蛋白質(zhì)復(fù)性和集成純化方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性和分離純化是生產(chǎn)基因重組藥物和高附加值基因產(chǎn)品的關(guān)鍵步驟。本文針對蛋白質(zhì)復(fù)性過程的兩個關(guān)鍵因素（促進二硫鍵形成和抑制蛋白質(zhì)聚集），開展蛋白質(zhì)復(fù)性助劑的研究和蛋白質(zhì)復(fù)性與集成純化方法的研發(fā)。
　　針對二硫鍵形成問題，從模擬蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）的疏水區(qū)域和正電區(qū)域出發(fā)，設(shè)計得到模擬寡肽RKCGCFF。研究表明，與傳統(tǒng)氧化劑GSSG和短肽RKCGC相比，RKCGCFF能夠更好地提高變性還原溶菌酶氧化復(fù)性的速率和收

2、率，且對較高濃度的溶菌酶也具有較好的輔助復(fù)性的效果。分析認為，由于RKCGCFF分子中同時引入了疏水區(qū)域和正電區(qū)域，使其在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上都更加接近于PDI，因此使其在促進二硫鍵形成的同時，又具有一定的抑制蛋白質(zhì)聚集的效果，亦即類似于PDI的分子伴侶功能。
　　針對蛋白質(zhì)聚集問題，基于前人研究發(fā)現(xiàn)的同電荷微球能夠有效抑制蛋白質(zhì)聚集，且其效果與介質(zhì)的電荷密度正相關(guān)的結(jié)論，本研究在二氧化硅納米粒子（SNPs）表面接枝聚乙烯亞胺分子（PEI

3、）并二次修飾2-二乙氨基氯乙基（DEAE），得到一系列高電荷密度以及高比表面積的陽離子納米顆粒。利用它們輔助帶正電荷的溶菌酶的氧化復(fù)性的研究表明，高電荷密度的納米粒子能夠在極低的介質(zhì)添加量時高效輔助同電荷溶菌酶的復(fù)性。與PGMA微米球相比，介質(zhì)用量下降了96％。由此證實，具有高電荷密度和比表面積的納米介質(zhì)更適合應(yīng)用于同電荷介質(zhì)輔助蛋白質(zhì)復(fù)性的方法中。
　　在上述研究的基礎(chǔ)上，針對重組蛋白在復(fù)性中的純化問題，本研究在瓊脂糖凝膠介質(zhì)（

4、Sepharose FF）表面修飾亞氨基二乙酸（IDA），制備得到一種金屬螯合介質(zhì)IDA-Sepharose FF。利用IDA的負電性質(zhì)和金屬螯合性質(zhì)，建立了一種同電荷輔助復(fù)性與集成純化的方法，用于輔助六聚組氨酸標記的重組增強型綠色熒光蛋白（6×his-EGFP）包含體的復(fù)性與純化。研究表明，IDA-Sepharose FF介質(zhì)能夠快速高效地輔助6×his-EGFP包含體的復(fù)性，并且在輔助復(fù)性的同時，能夠吸附部分雜蛋白，具有初步純化的效