新型蛋白質(zhì)氧化折疊助劑的分子設(shè)計(jì)和復(fù)性方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)復(fù)性是應(yīng)用基因重組技術(shù)在菌體中生產(chǎn)貴重蛋白質(zhì)的瓶頸。本文針對蛋白質(zhì)復(fù)性過程的兩個(gè)關(guān)鍵因素，二硫鍵形成和蛋白質(zhì)聚集抑制，開展蛋白質(zhì)氧化折疊助劑的分子設(shè)計(jì)和復(fù)性方法研究。
　　 針對二硫鍵形成問題，開展蛋白質(zhì)氧化折疊動(dòng)力學(xué)研究，揭示二硫鍵形成是折疊過程中色氨酸包埋的前提條件，發(fā)現(xiàn)混合二硫鍵的形成是控制第一折疊相折疊速率的關(guān)鍵因素。
　　 在此基礎(chǔ)上開展氧化折疊助劑的分子設(shè)計(jì)。首先考察蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)和Dsb

2、A的結(jié)構(gòu)特性，發(fā)現(xiàn)其活性位點(diǎn)周圍具有疏水性表面。因此，設(shè)計(jì)具有疏水尾的小分子折疊酶模擬物?；装纷鳛樾滦脱趸郫B助劑分子。研究表明，?；装纺軌蛟趶?qiáng)還原環(huán)境下有效地促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化復(fù)性，這是其它任何氧化劑所不能做到的。并且，?；装纺軌驑O大地提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性速率，在較低濃度下依然有效，僅需胱胺濃度的一半即可獲得相同的復(fù)性效果。其作用機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，?；装吠ㄟ^疏水烷基鏈介導(dǎo)與變性蛋白質(zhì)之間形成疏水相互作用，獲得其促進(jìn)復(fù)性的顯著效果。

3、>　　 其次，研究發(fā)現(xiàn)PDI的模擬分子氧化型寡肽CGC作為氧化折疊助劑可顯著提高蛋白質(zhì)氧化復(fù)性的速率和收率。以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)新型氧化折疊助劑分子RKCGC。研究表明，RKCGC能夠與二硫蘇糖醇很好地耦合，促進(jìn)二硫鍵的形成和異構(gòu)，具有較寬的適用pH范圍。且與CGC相比，RKCGC能夠更好地提高氧化復(fù)性的速率和收率。其作用機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，RKCGC具有更低的pKa值和更高的還原勢，因而獲得較好的輔助復(fù)性效果。
　　 針對蛋白質(zhì)聚集問題

4、，開展抑制聚集方法研究，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)帶有同種電荷的離子交換介質(zhì)能夠很好地抑制折疊中間體聚集從而促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性。通過四種帶不同電荷的離子交換介質(zhì)對三種帶不同電荷的蛋白質(zhì)輔助復(fù)性研究，證實(shí)同電荷離子交換介質(zhì)能夠有效促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性，且在高蛋白質(zhì)濃度(4 mg/mL溶菌酶；2 mg/mL牛血清白蛋白)條件其促進(jìn)復(fù)性效果依然非常顯著，而且不會降低復(fù)性速率，優(yōu)于其它化學(xué)添加劑。其作用機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，同電荷離子交換介質(zhì)通過靜電斥力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在其帶電表面