part1-2--分子生物物理-蛋白質(zhì)的折疊

1、1,蛋白質(zhì)折疊問(wèn)題是生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿課題之一，并且被列為“21世紀(jì)的生物物理學(xué)”的重要課題，它是分子生物學(xué)中心法則尚未解決的一個(gè)重大生物學(xué)問(wèn)題。從一級(jí)序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步預(yù)測(cè)其功能，是極富挑戰(zhàn)性的工作。研究蛋白質(zhì)折疊，尤其是折疊早期過(guò)程，即新生肽段的折疊過(guò)程是全面的最終闡明中心法則的一個(gè)根本問(wèn)題。,第二章 蛋白質(zhì)的折疊,2,遺傳信息的傳遞,,DNA,,RNA,,Proteins,多肽鏈,,有活性的蛋白質(zhì)天然構(gòu)象,實(shí)

2、質(zhì)上是多肽鏈,遺傳信息的傳遞應(yīng)該是從核苷酸序列到有完整結(jié)構(gòu)的功能蛋白質(zhì)的全過(guò)程。,3,定義：蛋白質(zhì)折疊是多肽鏈憑借相互作用在細(xì)胞環(huán)境（特定的酸堿度、溫度等）下自己組裝自己，從無(wú)規(guī)卷曲（去折疊態(tài)）折疊到三維功能結(jié)構(gòu)（天然態(tài)）的物理過(guò)程。,§2.1 蛋白質(zhì)折疊的基本概念和研究概況,4,DNA RNA 蛋白質(zhì)（新生肽鏈）新生肽鏈必須經(jīng)歷一系列極其復(fù)雜的加工過(guò)程，包括氨基酸殘基的化學(xué)修飾諸如二硫鍵的形成、

3、糖基化作用、羥基化作用、磷酸化作用等?，F(xiàn)在已知的與翻譯同時(shí)進(jìn)行或在翻譯完成后進(jìn)行的化學(xué)修飾反應(yīng)已經(jīng)超過(guò)100種。新生肽鏈必須進(jìn)行折疊，才能形成一定的三維結(jié)構(gòu)。每一個(gè)新合成的多肽鏈都必須轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)特定的場(chǎng)所或者被分泌到細(xì)胞外區(qū)域發(fā)揮作用。這些轉(zhuǎn)運(yùn)往往需要經(jīng)過(guò)一次甚至多次的跨膜過(guò)程。完全折疊好的蛋白質(zhì)是不能跨越細(xì)胞膜的，因此如果折疊過(guò)早，還要先去折疊，才能跨膜運(yùn)輸?shù)教囟ǖ陌l(fā)揮其生物功能的場(chǎng)所，再最終折疊成為功能蛋白。,,,5,多亞基蛋

4、白還要進(jìn)行亞基的組裝。許多以前體形式合成的蛋白，如一些蛋白酶等還必須經(jīng)過(guò)水解除去前體分子中的“前序列”才能轉(zhuǎn)變成具有活性的酶分子。新生肽只有折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，才能獲得特定的生物學(xué)功能，成熟為功能蛋白分子。新生肽的折疊不僅指肽鏈在空間的盤(pán)卷，而是包括廣義的新生肽鏈的整個(gè)成熟過(guò)程，包括化學(xué)修飾、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、亞基組裝、水解激活等。,6,20世紀(jì)50年代Fraekel和Williams從煙草斑紋病毒分離出外殼蛋白和核糖核酸，在體外生理?xiàng)l

5、件下重組得到有感染活力的病毒粒子。60年代美國(guó)生物化學(xué)家安芬森（Anfinsen） 根據(jù)還原變性的牛胰核糖核酸酶在去除變性劑和還原劑后，不需要任何其他物質(zhì)的幫助，能夠自發(fā)的形成正確的4對(duì)二硫鍵，重新折疊成天然的三維結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)幾乎全部生物活性的實(shí)驗(yàn)，提出“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必須的全部信息”或者說(shuō)“一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)”的著名論斷，為此Anfinsen 獲得1972年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。,蛋白質(zhì)折疊研究

6、的概況,7,Anfinsen's work, 1957-63: Formation of native disulfide bonds in ribonuclease A and other proteins. Key discovery: The information needed for folding is contained in the amino acid sequence.,Anfinsen 對(duì) Ribonu

7、clease 的研究提出了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)的假說(shuō)。,8,這些經(jīng)典的工作開(kāi)辟了近代蛋白質(zhì)折疊的研究，形成了蛋白質(zhì)折疊自組裝（self－assembly）的主導(dǎo)學(xué)說(shuō)。 Anfinsen 原理揭示了蛋白質(zhì)的氨基酸序列決定蛋白質(zhì)分子在熱力學(xué)上穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的必然性，但是對(duì)于蛋白質(zhì)折疊的全過(guò)程，還有一些問(wèn)題需要闡明：一級(jí)結(jié)構(gòu)到底如何決定高級(jí)結(jié)構(gòu)？具有完整一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈又如何克服在動(dòng)力學(xué)上可能的能障，最終達(dá)到這個(gè)熱力學(xué)上最穩(wěn)定的狀態(tài)？

8、是否存在像三聯(lián)遺傳密碼那樣的第二套密碼，即氨基酸序列決定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的所謂的“折疊密碼” ？按照Anfinsen原理，在理論上應(yīng)該可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)其相應(yīng)的“唯一”的三維結(jié)構(gòu)，那么，如何由一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)？,9,近年來(lái)的研究表明蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)序變過(guò)程，可通過(guò)捕捉蛋白質(zhì)折疊的中間狀態(tài)了解蛋白質(zhì)折疊的全過(guò)程。在研究牛與人的α－乳清蛋白酸變性、熱變性和在中等濃度鹽酸胍溶液中變性時(shí)的各種物理性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在這些條件下都能形成

9、一種彼此類似但又不同于天然分子的結(jié)構(gòu)，具有與天然蛋白不同的新的物理狀態(tài)—“熔球態(tài)”。熔球態(tài)是蛋白質(zhì)折疊過(guò)程的中間態(tài)，與天然分子比較，雖然被動(dòng)性增加，不存在特定的牢固安排的側(cè)鏈基團(tuán)，但其結(jié)構(gòu)仍是緊密的，并且具有顯著的分子柔性，二級(jí)結(jié)構(gòu)含量很高。對(duì)大多數(shù)小分子量蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，變性的蛋白質(zhì)在沒(méi)有外力的情況下可以通過(guò)折疊達(dá)到天然狀態(tài)。,10,但對(duì)于很多體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊，往往還需要有其他輔助因子的參與，并伴隨有ATP的水解。因此，Ellis 于

10、1987年提出了蛋白質(zhì)折疊的“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”。這表明蛋白質(zhì)的折疊不僅僅是一個(gè)熱力學(xué)的過(guò)程，顯然也受到動(dòng)力學(xué)的控制。“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝并非都能自發(fā)完成，在相當(dāng)多的情況下是需要其他蛋白質(zhì)分子的幫助，這類幫助蛋白包括分子伴侶（molecular chaperone）與折疊酶。新的觀點(diǎn)在實(shí)質(zhì)上并不和Anfinsen理論相矛盾，屬于對(duì)蛋白質(zhì)折疊途徑或折疊的識(shí)別和組裝問(wèn)題上認(rèn)識(shí)的完善 。,11,蛋白質(zhì)折疊的研究

11、內(nèi)容,蛋白質(zhì)折疊的研究，狹義的定義就是研究蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律、穩(wěn)定性及與其生物活性的關(guān)系。在概念上有熱力學(xué)的問(wèn)題和動(dòng)力學(xué)的問(wèn)題；有在體外折疊和在細(xì)胞內(nèi)折疊的問(wèn)題；有理論研究和實(shí)驗(yàn)研究的問(wèn)題。,12,變性：蛋白質(zhì)受到某些物理因素如熱、紫外照射、高壓和表面張力等或化學(xué)因素如有機(jī)溶劑、脲、鹽酸胍、酸、堿等的影響，會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)的變性。變性作用不涉及共價(jià)鍵的斷裂，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)保持完好，但高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，天然構(gòu)象解體。 蛋

12、白質(zhì)變性的的化學(xué)本質(zhì)：維持高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵（氫鍵，離子鍵，疏水相互作用，范德華力等）被破壞，特別是氫鍵的破壞，從而具有活性的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象被破壞。 有些蛋白質(zhì)的變性是可逆的。 將變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)可以恢復(fù)其天然構(gòu)象，這個(gè)過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。,§2.2 蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)考慮,13,折疊去折疊變性復(fù)性,in vivo: 新生肽的折疊in vitro: 變性（去折疊）蛋白的

13、復(fù)性（重折疊）,14,變性后高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變,15,變性條件,1.　溫度2.　pH3.　鹽4.　變性劑,脲素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28 M鹽酸胍：HN=C(NH2)26 M去垢劑：十二烷基硫酸鈉 SDS,16,Native Protein Denatured,17,變性原理,破壞次級(jí)鍵不破壞共價(jià)鍵,溫度：較高時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚沉，凝固，不可逆pH ：破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質(zhì)鹽　：

14、活度，溶解度脲素：競(jìng)爭(zhēng)氫鍵,18,由于蛋白質(zhì)的功能決定于它們的天然構(gòu)象，因而過(guò)去研究工作集中在蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象上，而對(duì)變性態(tài)沒(méi)有給予足夠重視。目前，人們已知道蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸3、蛋白質(zhì)的水解和更新,19,關(guān)于蛋白質(zhì)折疊Anfinsen的經(jīng)典熱力學(xué)假說(shuō)： Anfinsen認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度

15、、離子強(qiáng)度等），整個(gè)系統(tǒng)的總Gibbs自由能取最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。,20,Anfinsen實(shí)驗(yàn)變性蛋白的復(fù)性實(shí)驗(yàn),從二硫鍵入手，提出假設(shè)，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其正確性材料: 牛胰核糖核酸酶含4對(duì)二硫鍵26-8440-9558-11065-72,-S-S-交聯(lián)方式: 7×5×3×1=105種，天然只占其中一種,21,牛胰核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu),22,Anfi

16、nsen實(shí)驗(yàn),模型一：空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對(duì)）模型二：生物合成的結(jié)果模型三：先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固,實(shí)驗(yàn)否定了前兩種假設(shè)，肯定了第三種,23,Anfinsen實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一：1. 脲變性。Ribonuclease + 8M脲 + ?-巰基乙醇，脲使得肽鏈展開(kāi)，酶失活；2. 透析除脲和?-巰基乙醇；3. pH~8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中，重新氧化復(fù)性，酶活力重新獲得。,24,25,26

17、,?-巰基乙醇,一種有機(jī)化合物，其化學(xué)式為HOCH2CH2SH，英文通用縮寫(xiě)為ME或βME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團(tuán)，為揮發(fā)性液體，具有較強(qiáng)烈的刺激性氣味。βME通常用于二硫鍵的還原，可以作為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的抗氧化劑。由于β-巰基乙醇能夠打開(kāi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，它常常被用于蛋白質(zhì)分析。此外，β-巰基乙醇也常常被用于保護(hù)蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會(huì)錯(cuò)誤形成二硫鍵。,27,過(guò)量巰基乙醇導(dǎo)致

18、還原,脲變性,28,Anfinsen實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)二1. 同上。Ribonuclease + 8M脲 + ?-巰基乙醇，脲使得肽鏈展開(kāi)，酶失活；2. 透析除巰基乙醇，然后通O2，再透析除脲。結(jié)果：酶活性恢復(fù)到~0.01,29,錯(cuò)配的二硫鍵只需要加一點(diǎn)點(diǎn)巰基乙醇就可復(fù)性,30,Anfinsen實(shí)驗(yàn),1. 由實(shí)驗(yàn)一可知，模型 2 不成立，因?yàn)殡x體條件下復(fù)性的蛋白具有全部酶活性（后來(lái)又有實(shí)驗(yàn)證明體外解折疊是完全的，全人工合成）。

19、2. 由實(shí)驗(yàn)二可知，模型 1 不成立，否則，復(fù)性的蛋白應(yīng)該具有幾乎全部酶活性。3. 模型 3 能夠解釋 both 結(jié)果。,結(jié)論：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu)形成三級(jí)結(jié)構(gòu)所需要的所有信息包含在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。,31,Anfinsen實(shí)驗(yàn)流程圖,32,Anfinsen實(shí)驗(yàn),Anfinsen實(shí)驗(yàn)的啟示：1. 成功需要一點(diǎn)點(diǎn)運(yùn)氣（簡(jiǎn)單的單結(jié)構(gòu)域蛋白）2. 抓住主要矛盾，善于洞察問(wèn)題的本質(zhì)3. 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐评聿皇堑玫秸_結(jié)論的必要條件,正

20、確的前提＋正確的推導(dǎo)＝正確的結(jié)論正確的前提＋錯(cuò)誤的推導(dǎo)＝正確或錯(cuò)誤的結(jié)論錯(cuò)誤的前提＋正確的推導(dǎo)＝錯(cuò)誤的結(jié)論（大概率）錯(cuò)誤的前提＋錯(cuò)誤的推導(dǎo)＝正確或錯(cuò)誤的結(jié)論,Model 1 and 2 都有實(shí)驗(yàn)支持,33,同時(shí)代取得的其它一些結(jié)果,Ribonuclease A 去除 C-末端殘基后，蛋白質(zhì)就喪失了正確形成二硫鍵的能力。 (H. Taniuchi, J. Biol. Chem. 245, 5459-5468; 1970) 折疊

21、是以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行的。含有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，相鄰結(jié)構(gòu)域的解折疊是近似相互獨(dú)立的。,34,§2.3 折疊的動(dòng)力學(xué)考慮,有無(wú)中間體？最低自由能構(gòu)象如何達(dá)到？折疊過(guò)程是怎樣的？,35,單一結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，不存在平衡中間態(tài)。,兩態(tài)折疊,36,折疊中間態(tài)的發(fā)現(xiàn),首先在折疊、去折疊的早期動(dòng)力學(xué)時(shí)相（快速反應(yīng)）中發(fā)現(xiàn)。(Cytochrome c: A. Ikai and C. Tanford, Nature 230, 100

22、-102; 1971; ribonuclease A: T. Y. Tsong, R.L. Baldwin and E.L. Elson, PNAS 68, 2712-2715; 1971.),37,折疊中間態(tài)?,無(wú)輔基肌紅蛋白(Apo-Mb)變性圖,,圓二色譜：殘基摩爾橢圓度,38,蛋白質(zhì)折疊研究技術(shù),研究表明：每種蛋白質(zhì)都用自身偏好的方式進(jìn)行折疊。某些蛋白質(zhì)可在十億分之幾秒內(nèi)折疊起來(lái)，某些則要耗費(fèi)數(shù)毫秒才能卷縮成首選結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)

23、折疊如此之快，所以對(duì)其研究很困難。 費(fèi)城賓夕法尼亞大學(xué)Feng Gai研究組創(chuàng)造出極簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)，可折疊成最普通的螺旋。對(duì)蛋白質(zhì)上氨基酸用C13標(biāo)記，將它們放入水浴并用激光照射整個(gè)系統(tǒng)。激光對(duì)蛋白質(zhì)加熱十億分之三秒，使其打開(kāi)折疊。然后在重新折疊時(shí)用紅外光譜觀察C13和其他原子間化學(xué)鍵的變化情況。記錄一段“延長(zhǎng)了的”信號(hào)，表明蛋白質(zhì)以不同的速度不同的途徑進(jìn)行折疊。 Weizmann研究小組將蛋白“誘騙”到由脂質(zhì)構(gòu)成的小泡中，小泡約10

24、0 nm寬，蛋白質(zhì)在小泡中可自由移動(dòng)，能夠被聚焦的激光束完全照射到（激光束約為300 nm寬）。研究證明即使最終形狀一樣的蛋白質(zhì)也通過(guò)不同路線折疊。,39,多種技術(shù)結(jié)合：光譜學(xué)，波譜學(xué)和x 射線分析。快速核磁共振技術(shù)已經(jīng)能夠在秒到皮秒的時(shí)間域上觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)過(guò)程，其中包括主鏈和側(cè)鏈的運(yùn)動(dòng)，以及在各種不同的溫度和壓力下蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過(guò)程?？焖俟庾V技術(shù)（熒光，遠(yuǎn)紫外和近紫外圓二色?,蛋白質(zhì)折疊研究技術(shù),40,快速檢

25、測(cè)蛋白質(zhì)折疊的方法,停流,41,通過(guò)二硫鍵捕捉中間體,碘乙酸抑制二硫鍵的生成，在不同的時(shí)間加入碘乙酸，得到二硫鍵數(shù)目不同，構(gòu)象不同的蛋白質(zhì)，然后利用柱層析分離。,42,蛋白質(zhì)折疊過(guò)程的時(shí)間尺度,43,多肽鏈能夠采取的構(gòu)象個(gè)數(shù)是個(gè)天文數(shù)字， 平均每個(gè)aa可以有10種構(gòu)象，100個(gè)aa的多肽鏈有10100種可能的構(gòu)象。從一個(gè)構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€(gè)構(gòu)象所需最短時(shí)間10－15 s，則該蛋白嘗試所有的構(gòu)象的時(shí)間是1085 s=1077

26、y，而人們觀察到蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外折疊的時(shí)間是10-1～10-3 s。 結(jié)論：蛋白質(zhì)的折疊不是隨機(jī)嘗試所有可能的構(gòu)象直到遇到某個(gè)自由能最低的構(gòu)象，而是沿著某些確定的途徑進(jìn)行的。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象未必是最低自由能的構(gòu)象，而是動(dòng)力學(xué)途徑中所能得到的穩(wěn)定的構(gòu)象。,44,對(duì)蛋白折疊過(guò)程的共識(shí)——兩種過(guò)程,成核：小蛋白多步：大蛋白，以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝?45,(去)折疊過(guò)程中的限速步驟,1. 脯氨酸異構(gòu) 脯氨酸異構(gòu)是一個(gè)慢反應(yīng)(

27、秒)，去折疊形式下發(fā)生， 產(chǎn)生折疊過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)中間態(tài)。 (J.-R. Garel and R.L. Baldwin, PNAS 70, 3347-3351; 1973; J.F. Brandts, H.R. Halvorson and M. Brennan, Biochemistry 14, 4953-4963; 1975; F.X. Schmid and R.L. Baldwin, PNAS 75, 4764-4768; 1978)

28、.,脯氨酸異構(gòu)造成的動(dòng)力學(xué)曲線復(fù)雜化不屬于折疊中間態(tài),46,(去)折疊過(guò)程中的限速步驟,2. 二硫鍵異構(gòu)如前所述，略,47,蛋白質(zhì)折疊的啟動(dòng),疏水塌縮經(jīng)熔球中間態(tài) （molten globule state）二級(jí)結(jié)構(gòu)生成框架結(jié)構(gòu)模型特殊作用的啟動(dòng)Disulfide bonds去折疊態(tài)中的殘留有序結(jié)構(gòu),48,快速可逆形成一些二級(jí)結(jié)構(gòu),通過(guò)折疊核心的延展形成一些結(jié)構(gòu)域,通過(guò)結(jié)構(gòu)域的組裝形成“熔球態(tài)”,結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的調(diào)整,形成蛋白

29、單體,49,1、局部肽段形成一些構(gòu)象單元（?螺旋、?折疊和?轉(zhuǎn)角等）——Motifs——三級(jí)結(jié)構(gòu)；2、肽鏈內(nèi)部的疏水作用引起一個(gè)塌陷過(guò)程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。3、 “熔球態(tài)”的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本形成，蛋白質(zhì)的整體空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模。在熔球態(tài)時(shí)，分子立體的結(jié)構(gòu)再作一些局部調(diào)整，最后形成正確的立體結(jié)構(gòu)。,50,折疊過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模擬,動(dòng)力學(xué)模擬能夠成功的再現(xiàn)折疊過(guò)程的細(xì)節(jié)，例如過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)(D. Ba

30、ker, Nature 405, 39-42; 2000)和折疊中間體 (C. Clementi, P.A. Jennings and J.N. Onuchic, PNAS 97, 5871-5876; 2000),51,Bakei, D.等認(rèn)為， 如果多肽鏈所采取的構(gòu)象中只有一個(gè)低自由能狀態(tài)，即天然構(gòu)象，則所有非天然構(gòu)象多肽鏈將遵循經(jīng)典熱力學(xué)假說(shuō)，由高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，最終形成天然構(gòu)象。 但有些蛋白，天

31、然構(gòu)象也許并非是多肽鏈自由能最低的構(gòu)象或唯一的低能構(gòu)象，多肽鏈采取非天然的構(gòu)象也很穩(wěn)定，而這兩種構(gòu)象之間轉(zhuǎn)變需要克服很高勢(shì)壘而難以實(shí)現(xiàn)，那么蛋白質(zhì)在折疊過(guò)程中就會(huì)有兩種途徑的競(jìng)爭(zhēng)，一種是正確折疊形成天然構(gòu)象，一種是錯(cuò)誤折疊形成非天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)之所以能夠形成正確的構(gòu)象，是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)過(guò)程中起驅(qū)動(dòng)作用。,52,折疊過(guò)程模擬視頻,53,§2.4 蛋白質(zhì)折疊的理論模型,框架模型（Framework Model）

32、疏水塌縮模型（Hydrophobic Collapse Model）擴(kuò)散-碰撞-粘合模型 （Diffusion-Collision-Adhesion Model）成核-凝聚-生長(zhǎng)模型（Nuclear-Condensation-Growth Model）拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）熔球態(tài)模型（molten globule）,54,框架模型（Framework Model）,P. S. Kim 和R. L.

33、Baldwin 于1982 年提出， 假設(shè)蛋白質(zhì)局部構(gòu)象依賴于局部的氨基酸序列；在多肽折疊的起始階段，先迅速形成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，稱為“flickering cluster”；隨后二級(jí)結(jié)構(gòu)靠近，形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)框架；最后二級(jí)結(jié)構(gòu)框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。這個(gè)模型認(rèn)為即使是一個(gè)小分子的蛋白也可以一部分一部分的進(jìn)行折疊，其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。,55,疏水塌縮模型（Hydrophobic C

34、ollapse Model）,在疏水塌縮模型 中，疏水作用力被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中起決定性作用的力的因素。疏水片段首先聚集在一起，然后進(jìn)一步聚集長(zhǎng)大，形成蛋白中間體 ，進(jìn)而形成高級(jí)結(jié)構(gòu) 。在形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮。,56,擴(kuò)散-碰撞-粘合模型 (Diffusion-Collision-Adhesion Model）,蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個(gè)位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)上生成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)

35、單元或疏水簇，主要依靠局部序列（3-4個(gè)殘基）相互作用來(lái)維系。疏水簇以非特異性布朗運(yùn)動(dòng)方式擴(kuò)散、碰撞、相互黏附，導(dǎo)致大的結(jié)構(gòu)生成并增加穩(wěn)定性。進(jìn)一步碰撞形成具有疏水核心和二級(jí)結(jié)構(gòu)的類熔球態(tài)中間體。球形中間體調(diào)整為致密的、無(wú)活性的類似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無(wú)活性高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾谢盍Φ奶烊粦B(tài)。,57,擴(kuò)散-碰撞-粘合模型 初始階段示意圖,58,擴(kuò)散-碰撞-粘合模型 能量變化示意圖,59,成核-凝聚-生長(zhǎng)模型（

36、Nuclear-Condensation-Growth Model）,伸展多肽鏈開(kāi)始折疊時(shí)，肽鏈中的某些區(qū)域可以形成“折疊晶核”，由8-18個(gè)氨基酸殘基組成，它們隨機(jī)波動(dòng)，很不穩(wěn)定，多肽鏈的其它部分以它們?yōu)楹诵模麄€(gè)肽鏈繼續(xù)折疊進(jìn)而獲得天然構(gòu)象。所謂“晶核”實(shí)際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限

37、速步驟。,60,成核-凝聚-生長(zhǎng)模型 能量變化示意圖,61,拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）,中心思想是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進(jìn)行折疊，在沿每條途徑折疊的過(guò)程中都是天然結(jié)構(gòu)越來(lái)越多，最終形成天然構(gòu)象。每條途徑的折疊速度都較快，與單一途徑折疊方式相比，多肽鏈速度較快，另一方面，外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會(huì)給單一折疊途徑造成較大的影響 這些變化可能給某條折疊途徑帶來(lái)影響，但不影響另外的折疊途徑，

38、因而不會(huì)從總體上干擾多肽鏈的折疊。,62,分為二維模型和三維模型兩類。二維格點(diǎn)模型就是在平面空間中產(chǎn)生正交的單位長(zhǎng)度的網(wǎng)格，每個(gè)氨基酸分子按在序列中排序的先后順序依次放置到這些網(wǎng)格交叉點(diǎn)上，在序列中相鄰的氨基酸分子放置在格點(diǎn)中時(shí)也必須相鄰，即相鄰氨基酸分子在格點(diǎn)模型中的距離為1。網(wǎng)格中的每個(gè)交叉點(diǎn)最多只能放置一個(gè)氨基酸分子，如果序列中的某個(gè)氨基酸分子已經(jīng)放置在此位置上，則后序的氨基酸分子就不可以再放置在這個(gè)格點(diǎn)上。三維格點(diǎn)模型和二維格點(diǎn)

39、模型相似，它是在三維空間中產(chǎn)生的單位長(zhǎng)度的立體網(wǎng)格。格點(diǎn)中放置氨基酸分子的方法和二維的相同，但在二維格點(diǎn)模型中放置氨基酸分子時(shí)除了序列前兩個(gè)氨基酸分子外最多只有三個(gè)方向可以選擇，而在三維格點(diǎn)模型中復(fù)雜度提高了很多，放置氨基酸分子最多可以有五個(gè)方向可選。,格點(diǎn)模型（HP模型）,63,多肽鏈折疊分為三個(gè)階段，在多肽鏈折疊的起始階段類似“拼圖模型”，多肽鏈沿多條途徑迅速形成許多具有一些局部結(jié)構(gòu)的中間體，折疊的中間階段類似“成核/快速生長(zhǎng)模型”

40、的快速生長(zhǎng)階段，多肽鏈在第一階段形成的局部結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行快速折疊“生長(zhǎng)”形成具有較多天然結(jié)構(gòu)的中間體，復(fù)性的最后階段是中間體向天然構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，這是整個(gè)折疊過(guò)程中的限速步驟。,動(dòng)力學(xué)模型(The kinetic model),64,蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)模型　U1-6:伸展多肽鏈I1-3:具有局部結(jié)構(gòu)的中間體I4:具有較多天然結(jié)構(gòu)的中間體NN:天然構(gòu)象,65,這些模型各有特點(diǎn)，這與模型提出者們各自研究的對(duì)象及側(cè)重點(diǎn)不同有關(guān)，它們之間

41、有許多相似之處，如“框架模型”與“擴(kuò)散-碰撞-締合模型”中各自所指的“微結(jié)構(gòu)域”和“flickering cluster”型” 和“成核/快速生長(zhǎng)模型”的一些觀點(diǎn)。Baldwin.R.L為在多肽鏈的始階段，“疏水折疊”和二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成（框架模型）就是互補(bǔ)的，它們?cè)诙嚯逆溦郫B的起始階段可以同時(shí)存在。因?yàn)樵凇叭芮蝮w”中就有大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)。,66,除了這些折疊模型外，還有學(xué)者從另外的角度來(lái)考慮多肽鏈在體內(nèi)快速折疊的問(wèn)題，如Karplus等用M

42、onte Carol法對(duì)200個(gè)隨機(jī)序列的折疊動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中30種能快速折疊，而其中146種折疊速度很慢。他們認(rèn)為，在生物進(jìn)化過(guò)程中，自然界容易選擇那些能快速折疊而最終達(dá)到熱力學(xué)上穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的序列，而那些折疊緩慢的多肽鏈在生物體內(nèi)容易被蛋白酶降解而被自然界淘汰。,67,另外，多肽鏈在體內(nèi)的快速折疊顯然是由生物體內(nèi)這個(gè)特殊的生理環(huán)境所決定的，折疊過(guò)程受到許多酶的催化，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPI)等，

43、分子伴侶在這個(gè)過(guò)程中也會(huì)起到重要作用，多肽鏈在體內(nèi)折疊還可能是伴隨著翻譯/轉(zhuǎn)移進(jìn)行的。Bergman,L.W.和Kuebl.W.M.發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白輕鏈的Cys35-Cys100這對(duì)天然二硫鍵是伴隨著多肽鏈的翻譯及向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中形成的，說(shuō)明多肽鏈N端部分在翻譯還未完成時(shí)就可能開(kāi)始折疊，這顯然也是多肽鏈在體內(nèi)快速折疊的一個(gè)原因。,68,§2.5 幫助新生肽折疊的蛋白（輔助蛋白）,分子伴侶折疊酶分子內(nèi)伴侶,Ellis1

44、987年提出了蛋白質(zhì)“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”。相對(duì)于“自組裝”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質(zhì)分子的幫助。,69,分子伴侶（chaperone）——蛋白質(zhì)的保姆,許多蛋白質(zhì)的多肽單體在離體條件下能折疊、組裝成具有生物學(xué)功能的聚合體，但在體內(nèi)絕大多數(shù)新生肽三維結(jié)構(gòu)的形成，需要一類稱為分子伴侶的輔助蛋白的存在?！　》肿影閭H是能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過(guò)有控制的結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽的折疊、多聚體的裝配

45、或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)鹊囊活惖鞍??！　≡趧?dòng)物、植物、細(xì)菌內(nèi)廣泛分布和存在，其功能是介導(dǎo)其它蛋白質(zhì)的折疊和裝配，而本身卻不是最終功能蛋白質(zhì)分子的組成部分。,70,定義,分子伴侶：(chaperone或molecular chaperone，也可譯為伴侶蛋白)，是細(xì)胞內(nèi)的一類保守蛋白質(zhì)，在序列上沒(méi)有相關(guān)性但有共同功能，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)可識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象，幫助其完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時(shí)

46、的組份。,71,分子伴侶的特征,從參與促進(jìn)一個(gè)反應(yīng)而本身不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)這一點(diǎn)來(lái)看，分子伴侶具有酶的特征。但從以下三方面來(lái)看，分子伴侶和酶很不同。1、分子伴侶對(duì)靶蛋白沒(méi)有高度專一性，同一分子伴侶可以促進(jìn)多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能都不相關(guān)的蛋白質(zhì)。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構(gòu)象，釋放底物，進(jìn)行再循環(huán)。3、它和肽鏈折疊的關(guān)系，主要是阻止錯(cuò)誤折疊，而不是促進(jìn)正確折疊。4、多

47、能性（脅迫保護(hù)防止交聯(lián)聚沉，轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組裝細(xì)胞骨架）5、進(jìn)化保守性,72,分子伴侶的分類,伴侶素家族 (Charperonin, Cpn)GroEL/S (Hsp60)家族熱休克蛋白 70家族 (Hsp70)熱休克蛋白 90家族 (Hsp90)其它種類的分子伴侶,73,74,熱休克蛋白70家族促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的基本作用——結(jié)合保護(hù)待折疊多肽片段，再釋放該片段進(jìn)行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。,7

48、5,Hsp70 系統(tǒng)包括Hsp70、Hsp40 和GrpE。它們能作用于新合成的蛋白質(zhì)、跨膜運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)和在脅迫下變性的蛋白質(zhì)。這個(gè)系統(tǒng)的名字反應(yīng)了Hsp70蛋白質(zhì)最初是通過(guò)熱激（Heat shock）作用的誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)的，很多熱激蛋白質(zhì)都是分子伴侶。Hsp70 和Hsp40 都能獨(dú)立地與其蛋白質(zhì)底物結(jié)合。Hsp40 包括一個(gè)與Hsp70 相互作用的結(jié)構(gòu)域。Hsp70既與Hsp40 結(jié)合又與未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合。Hsp70與Hsp40之間的

49、相互作用激活了Hsp70 的ATPase 活性。與ADP結(jié)合的復(fù)合物與蛋白質(zhì)底物結(jié)合，并且一直持續(xù)到到GrpE將ADP 替換。這種替換造成復(fù)合物的解體，包括Hsp40解離，ATP 與Hsp70結(jié)合，然后Hsp70 解離。蛋白質(zhì)的折疊是經(jīng)過(guò)幾輪的結(jié)合與解離完成的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的鏈延長(zhǎng)時(shí)，Hsp70從一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上解離接著又重新結(jié)合到其它位點(diǎn)，使底物蛋白質(zhì)的一部分有序地正確折疊。最后，整個(gè)蛋白質(zhì)從核糖體上釋放，并折疊為成熟的構(gòu)象。,76,伴侶

50、素GroEL/GroES系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程,伴侶素的主要作用——為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。,77,Hsp60 家族分子伴侶組成一個(gè)大的包括兩種類型亞基的結(jié)構(gòu)。Hsp60 本身（在E. coli中稱為GroEL）形成具有14 個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)，以相反的方向互相堆疊成兩個(gè)七聚體環(huán)。就是說(shuō)，這兩個(gè)環(huán)的頂部及底部的表面是完全相同的。中心的空洞貫穿這兩個(gè)環(huán)，所以這個(gè)結(jié)構(gòu)像是一個(gè)中空的圓柱體。這個(gè)結(jié)構(gòu)與Hsp10（在

51、E. coli為GroES）亞基構(gòu)成的七聚體結(jié)合。一個(gè)GroES七聚體形成的隆起的鐘罩結(jié)構(gòu)與雙環(huán)中的一個(gè)表面結(jié)合。這個(gè)隆起位于活性中心的上方，覆蓋圓柱體的一個(gè)開(kāi)口。兩個(gè)GroEL 環(huán)一個(gè)是近端環(huán)（與GroES 結(jié)合）一個(gè)是遠(yuǎn)端環(huán)（未與GroES 結(jié)合）。 GroEL有時(shí)被稱為分子伴侶，而GroES被稱為輔分子伴侶 (Co-chaperonin)，因?yàn)镚roEL在指導(dǎo)折疊的過(guò)程中起到了重要的作用，而GroES 輔助它的活性功能。,78,G

52、roEL 能同許多未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，很可能是通過(guò)識(shí)別濃縮的“熔球（Molten globule）”狀態(tài)來(lái)完成的。與底物的相互作用是以底物表面和GroEL 暴露在活性空洞中殘基之間的疏水相互作用為基礎(chǔ)的。底物可能是已變性的蛋白質(zhì)；也可能是在其它分子伴侶的作用下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到GroEL 上——例如Hsp70 可幫助一個(gè)新生蛋白質(zhì)折疊，但隨后將其傳遞到GroEL上，這一過(guò)程直到它被核糖體釋放才結(jié)束。當(dāng)GroES 和底物結(jié)合在同一個(gè)環(huán)上時(shí)，就

53、發(fā)生折疊（有可能是底物先結(jié)合在GroEL/GroES復(fù)合物的遠(yuǎn)端環(huán)上，GroES解離下來(lái)再與另一個(gè)環(huán)結(jié)合）。當(dāng)GroES與GroEL結(jié)合后，它誘導(dǎo)近端GroEL的一個(gè)構(gòu)型變化，增加中心空洞的體積。這也改變了底物所處的環(huán)境。以前與底物結(jié)合的疏水殘基也涉及到與GroES的結(jié)合。結(jié)果使底物處在一個(gè)使其構(gòu)型發(fā)生改變的疏水環(huán)境中。,79,Chaperone and chaperone-mediated protein folding,80,ATP

54、在GroEL行使功能中起重要作用。每個(gè)GroEL的亞基都含有一個(gè)ATP分子。近端環(huán)上亞基上的ATP對(duì)于折疊是必要的。在這一步驟不需要水解。但底物的釋放需要水解，近端環(huán)上的ATP只起到間接的作用。近端環(huán)上ATP的水解降低了GroEL和GroES之間的親和性。GroES 和底物的釋放需要遠(yuǎn)端環(huán)的ATP 的水解。,81,82,83,84,分子伴侶作用視頻,85,折疊酶,蛋白質(zhì)多肽鏈的折疊過(guò)程中，還需要酶的催化，稱之為折疊酶。它們催化與蛋白質(zhì)折

55、疊直接有關(guān)的、對(duì)形成功能構(gòu)象所必需的共價(jià)鍵變化，幫助蛋白質(zhì)正確折疊。,86,折疊酶類型,許多研究表明，某些蛋白質(zhì)折疊的限速步驟是共價(jià)鍵的異構(gòu)化，需要相應(yīng)的酶催化。(1) 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 PDI (Protein disulfide isomerase)(2) 肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶PPI (Peptidyl prolyl cis/trans isomerase),87,蛋白二硫鍵異構(gòu)酶 (PDI),真核生物的PDI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很

56、高，細(xì)菌中的類似物是Dsb家族，位于細(xì)菌外周質(zhì)(periplasm)，在肽鏈中催化錯(cuò)配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白質(zhì)形成熱力學(xué)最穩(wěn)定的天然構(gòu)象。通過(guò)催化巰基與二硫鍵的交換反應(yīng)，從而催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、還原（斷裂）或重排（異構(gòu)化）。在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌蛋白的正確折疊。,88,肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶 (PPI),PPI廣泛分布于各種生物體及各種組織中，多數(shù)定位于胞漿，但也存在于大腸桿菌的外周質(zhì)

57、、紅色面包霉的線粒體基質(zhì)、酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶是蛋白質(zhì)三維構(gòu)象形成的限速酶，在細(xì)胞中通過(guò)非共價(jià)鍵方式，穩(wěn)定扭曲的酰胺過(guò)度態(tài)，而催化肽基脯氨酰順?lè)词降南嗷マD(zhuǎn)變。在肽鏈合成后需形成順式構(gòu)型時(shí)，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準(zhǔn)確折疊。,89,PDI和PPI不僅可以起到折疊酶的催化作用，而且具有防止折疊中間體聚集的類似分子伴侶的功能。王志珍等最早提出PDI是分子伴侶的假說(shuō)并驗(yàn)證了PDI的這一功能。,90,分子內(nèi)伴

58、侶 (intramolecular chaperones),1987年，Ikemura發(fā)現(xiàn)枯草桿菌素 (subtilisin)的折疊需要前肽 (propeptide)的幫助。這類前肽常位于信號(hào)肽與成熟多肽之間，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中與其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)多肽鏈?zhǔn)且磺耙缓蠛铣傻?，并以共價(jià)鍵相連接，是成熟多肽正確折疊所必需的，成熟多肽完成折疊后即通過(guò)水解作用與前肽脫離。Shinde和Inouye將這類前肽稱為分子內(nèi)伴侶。,91,§2.6 蛋

59、白質(zhì)折疊?。╢old disease),“分子病”——由于基因突變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)分子中僅一個(gè)氨基酸殘基的變化就引起的疾病?！罢郫B病”——或稱“構(gòu)象病”蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒(méi)有改變，即一級(jí)結(jié)構(gòu)正常，只是其二級(jí)結(jié)構(gòu)、乃至立體結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）異常而導(dǎo)致的疾病。,92,構(gòu)象病的種類,1、由朊病毒蛋白構(gòu)象變化所引起的疾?。褐滤兰易逍允甙Y、瘋牛病、羊瘙癢病等。2、淀粉樣蛋白等相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病：阿爾茨海默病、前額顳癡呆綜合征、肌肉萎縮外側(cè)硬化癥

60、、帕金森病。3、抑絲酶家族構(gòu)象異常所引起的疾病：遺傳性血管水腫、家族型早期發(fā)作癡呆腦病。,93,早在三百年前，人類在綿羊和小山羊中首次發(fā)現(xiàn)了“羊搔癢癥”。該病廣泛傳播于歐洲和澳洲，潛伏期18到26個(gè)月，患病動(dòng)物興奮、搔癢、癱瘓直至死亡。后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)了傳染性水貂腦軟化病、馬鹿和鹿的慢性消瘦病、貓的海綿狀腦病等。1996年春天英國(guó)蔓延的“瘋牛病”，它不僅引起英國(guó)一場(chǎng)空前的經(jīng)濟(jì)和政治動(dòng)蕩，也波及了整個(gè)歐洲。1983年“植物和動(dòng)物亞病

61、毒病源：類病毒和朊病毒國(guó)際會(huì)議”正式把朊病毒歸入亞病毒領(lǐng)域。,朊病毒導(dǎo)致的疾病 ( Prion Diseases),94,Scrapie羊瘙癢癥,Kulu克魯病,瘋牛病,95,人類已知的朊病毒疾病現(xiàn)有： 克雅氏?。ǚ▏?guó)克羅伊茨菲爾德—雅各布氏病， Creutzfeldt–Jakob disease，CJD）：自身PrP蛋白發(fā)生變異引起的。 變異型克-雅氏?。╲CJD）：PRION感染。 GSS綜合征（格斯特曼綜合癥，Gerst

62、mann-Straussler Scheinker disease）：由Prnp基因缺陷引起。 克魯病（震顫病， Kuru）：PRION感染。 致死性家族性失眠癥（Fatal familial insomnia，F(xiàn)FI）：Prnp基因變異。 1976年諾貝爾獎(jiǎng)（Carleton Gajdusek）：Kuru 1997年諾貝爾獎(jiǎng)（ Stanley Prusiner ）： PrPsc 動(dòng)物：羊瘙癢?。⊿crapie）、牛海綿腦?。?/p>

63、BSE 俗稱瘋牛?。┖吐埂⒇?、水貂等的海綿腦病。 致病蛋白質(zhì)分子與正常蛋白質(zhì)分子的組成完全相同，只是空間結(jié)構(gòu)不同。,96,瘋牛病,牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)：俗稱瘋牛病(mad cow disease) ，1986年首次在英國(guó)報(bào)道。該病潛伏期4～5年，發(fā)病初期表現(xiàn)為體質(zhì)變差，體重減輕，產(chǎn)奶量下降等非特異性癥狀。隨后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀逐步明顯，出現(xiàn)小腦共濟(jì)失調(diào)、震顫等，由于病牛常

64、表現(xiàn)出感覺(jué)過(guò)敏、恐懼甚至狂亂，因此俗稱“瘋牛病”。 死亡率100% ——可能威脅人類生存 比愛(ài)滋病更可怕 ——無(wú)法找到防治疫苗 瘋牛病毒殺不死 ——常規(guī)消毒殺不死 瘋牛病防不勝防 ——醫(yī)療用品食品傳播　　　　　　　　　 化妝品也不能排除,97,瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein, PrP) 錯(cuò)誤折疊引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變

65、。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。這種結(jié)構(gòu)比較脆弱，容易發(fā)生變異。 PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹浅７€(wěn)定β-折疊結(jié)構(gòu)的PrPsc，變異PrP能夠促使正常PrP發(fā)生變異，形成淀粉狀纖維，殺死神經(jīng)細(xì)胞從而致病。正常和變異的PrP成分相同，都由253個(gè)氨基酸構(gòu)成。,98,PrPc,PrPsc,99,朊病毒,朊病毒病的病原體究竟是什么？ 蓋杜賽克等曾將庫(kù)魯病死者腦組織制成無(wú)菌、無(wú)原蟲(chóng)的懸浮液，注入黑猩猩的顱腔，20個(gè)

66、月時(shí)，黑猩猩發(fā)病，其癥狀與人相似，提示病原體不是細(xì)菌或原蟲(chóng)。 20世紀(jì)60年代，英國(guó)放射生物學(xué)家阿普（T. Alper）將羊搔癢癥致病組織用會(huì)導(dǎo)致核酸失活的放射線輻射，發(fā)現(xiàn)處理過(guò)的致病組織仍有傳染性，提出羊搔癢癥的病因可能是不含核酸的蛋白質(zhì)，但這樣的觀點(diǎn)有悖于“核酸為中心”的觀念，因而當(dāng)時(shí)未得到人們的重視。,100,直至1982年，美國(guó)神經(jīng)學(xué)與生物化學(xué)家魯辛納在致病因子的探尋方面作了8年研究之后，提出該致病因子確實(shí)不含核酸，而是蛋白質(zhì)

67、。為了能把他與細(xì)菌、真菌、病毒及其他已知病原體相區(qū)別，他將這種蛋白質(zhì)致病因子定名為朊病毒（Prion），對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)單體稱為朊病毒蛋白，相應(yīng)疾病稱為朊病毒病。1997年美國(guó)生物學(xué)家斯垣利·普魯辛納（ S. B. Prusiner）由于研究朊病毒獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。,101,朊病毒與常規(guī)病毒一樣: 可濾過(guò)性 傳染性 致病性 對(duì)宿主范圍的特異性但它比已知的最小的常規(guī)病毒還小得多（約30～50 nm）。電鏡下觀察不到

68、病毒粒子的結(jié)構(gòu)，且不呈現(xiàn)免疫效應(yīng)，不誘發(fā)干擾素產(chǎn)生，也不受干擾作用。,102,朊病毒是蛋白質(zhì)，沒(méi)有核酸，是正常的蛋白質(zhì)由良性轉(zhuǎn)為惡性，由沒(méi)有感染性轉(zhuǎn)化為感染性；沒(méi)有病毒的形態(tài)，是纖維狀的東西；對(duì)蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑如苯酚、尿素等的處理無(wú)耐受性，但卻有不同于一般蛋白質(zhì)的特征，即耐高溫性和抗蛋白酶性。對(duì)所有殺滅病毒的物理化學(xué)因素均有抵抗力，現(xiàn)在的消毒方法都無(wú)用，只有在136℃高溫和2h的高壓下才能滅活；病毒潛伏期長(zhǎng)，從感染到發(fā)病平均28年，一

69、旦出現(xiàn)癥狀半年到一年100%死亡；朊病毒目前尚未有有效的治療方法，因此屬“不治之癥” 。,103,朊病毒致病,朊病毒蛋白既然是動(dòng)物細(xì)胞基因編碼的產(chǎn)物，為什么并不引起全部動(dòng)物致?。?這是由于朊病毒蛋白分子本身不能致病，而必須發(fā)生空間結(jié)構(gòu)上的變化轉(zhuǎn)化為朊病毒才會(huì)損害神經(jīng)元。這一變化恰恰是朊病毒脅迫所致的。 一個(gè)致病分子先與一個(gè)正常分子結(jié)合，在致病分子的作用下，正常分子轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏》肿?，然后這兩個(gè)致病分子分別與兩個(gè)正常分子結(jié)合，再使后者轉(zhuǎn)