分子生物學(xué)的研究方法-dna-蛋白質(zhì)相互作用

1、第六節(jié) 研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法,又叫做DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)，是80年代初出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。簡單、快捷，是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離是同其分子量的對(duì)數(shù)成反比，如果DNA分子結(jié)合上一種蛋白質(zhì)，那么由于分子量加大，在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，朝正電極移動(dòng)的距離也就相在縮短了。所以當(dāng)特

2、定的DNA片段同細(xì)胞提取物混合之后，若其在凝膠電泳中的移動(dòng)距離變小了，這就說明它已同提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子發(fā)生了結(jié)合作用。,2.6.1 凝膠阻滯試驗(yàn)原理,返回目錄,返回第二章,凝膠阻滯試驗(yàn)方法,首先是用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段（亦稱探針DNA），然后同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，于是便有可能形成DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物。將它加樣到非變性的凝膠中，在控制使蛋白質(zhì)仍與DNA保持結(jié)合狀態(tài)的條件下進(jìn)行電泳分離，并應(yīng)用放射自顯影技術(shù)顯

3、現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置。如果細(xì)胞層白質(zhì)提取物中不存在可同放射性標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么所有放射性標(biāo)己都將集中出現(xiàn)在凝膠的底部；反之，將會(huì)形成DNA一蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于凝膠阻滯的緣故，其特有的放射性標(biāo)記的探針DNA條帶就將滯后出現(xiàn)在較靠近凝膠頂部的位置。所以有的文獻(xiàn)中也稱這種試驗(yàn)為條帶阻滯試驗(yàn)（band retardation assay）。,,凝膠阻滯試驗(yàn)用途,鑒定特殊細(xì)胞提取物中，是否存在可同放射性標(biāo)記的探針DNA結(jié)

4、合的蛋白質(zhì)分子（比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等）研究發(fā)生此種結(jié)合作用之精確的DNA序列的特異性：其辦法是在DNA一蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中，加入超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA。如果競(jìng)爭(zhēng)同一種蛋白，由于競(jìng)爭(zhēng)DNA與探針DNA相比是極大超量的，絕大部分蛋白質(zhì)都會(huì)被其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合掉而使探針DNA處于自由狀態(tài)，自顯影圖片上不出現(xiàn)阻滯的條帶，相反，如果不競(jìng)爭(zhēng)同一蛋白，探針DNA仍與特定蛋白復(fù)合，呈現(xiàn)阻滯的條帶。使用競(jìng)爭(zhēng)DNA，可間接闡明體內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。

5、如，使用一種具有與已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)DNA，就可以判斷檢測(cè)到的蛋白質(zhì)是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子，或是與之相關(guān)的其它轉(zhuǎn)錄因子；如果事先引入突變，可以檢測(cè)突變對(duì)其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響。,2.6.2 DNasel足跡試驗(yàn),盡管凝膠阻滯試驗(yàn)?zāi)軌蚪沂境鲈隗w內(nèi)發(fā)生的DNA蛋白質(zhì)之間相互作用的有關(guān)信息，然而它卻無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。要解答這個(gè)問題，則需要應(yīng)用 DNasel足跡試驗(yàn)（footprinting assay）。它是一類用于檢測(cè)與

6、特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。,DNasel足跡試驗(yàn)過程,首先是將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，并用限制酶去掉其中的一個(gè)末端，得到只一條鏈單末端標(biāo)記的雙鏈DNA分子體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物混合。待二者結(jié)合之后，再加入少量的 DNasel（它可沿著靶 DNA作隨機(jī)單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達(dá)到平均每條鏈只發(fā)生一次磷酸二脂鍵的斷裂。如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特異蛋白質(zhì)，經(jīng)D

7、Nasel消化之后便會(huì)產(chǎn)生出距放射性標(biāo)記末端1個(gè)核苷酸、2個(gè)核苷酸、3個(gè)核苷酸等一系列前后長度均僅相差一個(gè)核苷酸的、不間斷的、連續(xù)的DNA片段梯度群體。,從此混合物中除去蛋白質(zhì)之后，將DNA片段群體加樣在變性的DNA測(cè)序凝膠中進(jìn)行電泳分離，經(jīng)放射自顯影，便可顯現(xiàn)出相應(yīng)于DNasel切割產(chǎn)生的不同長度DNA片段組成的序列梯度條帶。但是，如果有一種蛋白質(zhì)已經(jīng)結(jié)合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么它就將保護(hù)這一區(qū)段的DNA免受DNasel的消

8、化作用，因而也就不可能產(chǎn)生出相應(yīng)長度的切割條帶。所以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位是沒有放射標(biāo)記條帶的，出現(xiàn)了一個(gè)空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡” 。,足跡試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn),可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過足跡試驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合位點(diǎn)的分布狀況。如同凝膠阻滯試驗(yàn)一樣，也可以加入非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA，來消除特定的足跡，據(jù)

9、此確定其核酸序列的特異性。,DNasel足跡試驗(yàn)發(fā)展,目前還出了若干種其它類型的足跡試驗(yàn)。例如，自由羥基足跡試驗(yàn)及菲咯琳銅足跡試驗(yàn)等。其中最有趣的是硫酸二甲脂（DMS）足跡試驗(yàn)。它所依據(jù)的原理是，DMS能夠促進(jìn)DNA中裸露的G甲基化，而六氫吡啶又會(huì)對(duì)甲基化的G殘基作特異的化學(xué)切割。假如有一種蛋白質(zhì)同DNA分子中的某一區(qū)段結(jié)合，在它的保護(hù)下，區(qū)域內(nèi)的G免受六氫吡啶的切割，于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具這些G殘基末端的DNA片段，故

10、出現(xiàn)個(gè)空白區(qū)域，此即通常所說的足跡。 與其它足跡試驗(yàn)不同，由于DMS足跡試驗(yàn)中被切割的是G殘基，因此可用來鑒定同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)段中的特異堿基。,2.6.3 甲基化干擾試驗(yàn),應(yīng)用甲基化干擾試驗(yàn)（methvlation interference assay）技術(shù)，可以檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。,甲基化干擾試驗(yàn)的具體操作

11、,先用硫酸二甲脂（DMS）處理靶DNA，控制反應(yīng)條件，使平均每條DNA分子只有一個(gè)G甲基化，而后將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結(jié)合蛋白的適當(dāng)?shù)募?xì)胞提取物一道溫育，并作凝膠阻滯試驗(yàn)。經(jīng)電泳分離之后，從凝膠中切取出具有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶和沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶，并用六氫吡啶處理之，于是甲基化的G殘基被切割，非甲基化的G殘基則不被切割。顯而易見，如果某個(gè)G因甲基化而不與蛋白質(zhì)結(jié)合，那么六氫吡啶對(duì)這個(gè)甲基化G殘基的切割作用，就

12、只能在沒有同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA分子上表現(xiàn)出來。相反地，如果一個(gè)特殊的G殘基在DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合中不起作用，那么六氫吡啶對(duì)這個(gè)G殘基的切割作用，則在同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA分子及不同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA分子中均可觀察到（圖2－44）,甲基化干擾試驗(yàn)的用途,甲基化干擾試驗(yàn)不僅可以用來研究蛋白質(zhì)與G殘基之間的聯(lián)系，而且同樣也可以用來研究DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與結(jié)合位點(diǎn)中的腺嘌呤A殘基之間的聯(lián)系作用。頭一個(gè)辦法是使所有的嘌呤殘基甲基化，以便同時(shí)研究甲基化

13、的G和A殘基對(duì)蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的干擾效應(yīng)。第二種辦法是使用焦碳酸二乙脂（DEPC）特異性修飾A，而使之易受六氫吡啶的切割作用。對(duì)于研究諸如像具有相對(duì)少數(shù)G殘基的八聚體基序（例如 OCt－1，OCt－2等，它們可與八聚體結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合）這樣的序列而言，這些甲基化干擾試驗(yàn)技術(shù)具有特別的價(jià)值，因?yàn)橹灰芯縂殘基的甲基化干擾，就可獲得有用的信息。,DMS化學(xué)干擾的主要局限性,它只能使G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。盡管如此，它仍不

14、愧為足跡試驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。,2.6.4 體內(nèi)足跡試驗(yàn),上面所討論的這三種方法有一個(gè)共同的不足之處，即它們都是在體外進(jìn)行的試驗(yàn)。因此人們自然會(huì)問，這些結(jié)果能夠確切地反映活細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA一蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況嗎？為了解答這個(gè)問題，科學(xué)工作者又設(shè)計(jì)出了一種體內(nèi)足跡試驗(yàn)體系。然而究其實(shí)質(zhì)而言，這種技術(shù)無非是體外DMS足跡試驗(yàn)的一個(gè)變種而已。,體內(nèi)足跡試驗(yàn)的方法,用有限數(shù)量的化學(xué)

15、試劑DMS處理完整的游離細(xì)胞，并使其滲透到細(xì)胞內(nèi)的濃度恰好導(dǎo)致天然染色質(zhì)DNA中的G殘基發(fā)生甲多化。而后從這些細(xì)胞中提取DNA，并加入六氫吡啶作體外消化。結(jié)果情況就如同體外足跡試驗(yàn)一樣，能同某種特殊蛋白質(zhì)因子結(jié)合的DNA區(qū)段，其上的G殘基就不會(huì)被DMS甲基化，因而也就不會(huì)被六氫吡啶所切割。因此，同對(duì)照的體外裸露DNA所形成的序列梯比較，就會(huì)發(fā)現(xiàn)由完整的活細(xì)胞染色質(zhì)DNA形成的序列梯中，缺少了G殘基沒有被切割的相應(yīng)條帶（圖2－45）。,體

16、內(nèi)足跡試驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn),顯而易見，與應(yīng)用克隆DNA片段所作的體外足跡試驗(yàn)的結(jié)果相比，經(jīng)體內(nèi)足跡試驗(yàn)從染色質(zhì)總DNA中所獲得的任何一種特異DNA的數(shù)量，都是微不足道的。因此，有必要通過PCR擴(kuò)增特異的靶DNA，以獲得足夠數(shù)量的DNA樣品。如今體內(nèi)足跡試驗(yàn)已發(fā)展成為研究在完整的活細(xì)胞內(nèi)，DNA一蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)合位點(diǎn)中堿基突變效應(yīng)的一種極有效的手段。,應(yīng)用凝膠阻滯試驗(yàn)、DNasel足跡試驗(yàn)、甲基化干擾試驗(yàn)，以及體內(nèi)足跡試驗(yàn)等多種用于研究DN

17、A與蛋白質(zhì)相互作用的基本實(shí)驗(yàn)手段，將有助于深入地探討基因啟動(dòng)子元件的結(jié)構(gòu)與功能，及其與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的有關(guān)細(xì)節(jié)；揭示mRNA轉(zhuǎn)錄超始和終止的分子本質(zhì)與主要步驟；闡明在發(fā)育過程中基因表達(dá)調(diào)節(jié)的時(shí)空特異性；以及外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)的分子機(jī)理，等等。這些研究結(jié)果，將為我們提供大量重要的信息，以最終弄清基因表達(dá)調(diào)節(jié)的真實(shí)內(nèi)容。,思考題,1、研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法有哪些？2、凝膠阻滯試驗(yàn)原理是什么？3、用圖示的方法