家蠶蠶蛹過敏原蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori Linaeus)是我國的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲,與此同時,家蠶又是一種重要的昆蟲致敏原。家蠶蠶蛹在傳統(tǒng)中醫(yī)中作為一種藥物被用來治療高血壓和脂肪肝,中國人有食蠶蛹的習(xí)慣,有關(guān)食用蠶蛹引發(fā)過敏的病例也時有報道,因此在中國,蠶蛹是一種重要的食物過敏原。本文旨在對家蠶蠶蛹的過敏原進(jìn)行研究。
　　 1.家蠶蠶蛹過敏原的SDS-PAGE和免疫印跡分析:首先利用超速離心法提取家蠶蠶蛹的總蛋白,用12％的SDS-PAGE對蛋

2、白粗提液進(jìn)行分離,之后分別用11份家蠶蠶蛹過敏病人的血清與蛋白進(jìn)行IgE結(jié)合測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn):家蠶蠶蛹的蛋白有10多條蛋白質(zhì)條帶,其中在25kDa附近3條為主帶。在與11份患者血清的反應(yīng)中,共檢測到分子量近似為28、35、37、65、90kDa的陽性蛋白條帶。其中28、35、37、65kDa處的蛋白條帶與血清的陽性反應(yīng)率達(dá)到了100％。提示家蠶蠶蛹中確實(shí)存在著特定的過敏原蛋白。
　　 2.家蠶蠶蛹過敏原的蛋白質(zhì)組學(xué)研究:本部分實(shí)驗(yàn)

3、目的是通過雙向電泳、免疫印跡、質(zhì)譜的方法對家蠶蠶蛹過敏原有更明確的研究。首先用雙向電泳對家蠶蠶蛹蛋白進(jìn)行分離,構(gòu)建較為完整的家蠶蠶蛹蛋白雙向電泳圖譜；接著利用免疫印跡方法,使電轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白與陽性家蠶蠶蛹過敏患者混合血清進(jìn)行反應(yīng),對于能夠與過敏病人血清中IgE結(jié)合的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:家蠶蠶蛹蛋白在雙向電泳中被成功分離,共得到288個蛋白點(diǎn)。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中,共有13個蛋白點(diǎn)可以與家蠶蠶蛹過敏病人血清發(fā)生陽性反應(yīng),而在陰性

4、對照中,未見其發(fā)生陽性反應(yīng)；對這13個陽性點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定后,發(fā)現(xiàn)它們分別屬于6類不同的蛋白:卵黃原蛋白、30K家族蛋白、幾丁質(zhì)酶、丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶、熱休克蛋白20.8和家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑。
　　 3.家蠶蠶蛹過敏原蛋白幾丁質(zhì)酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建。本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟跇?gòu)建家蠶蠶蛹幾丁質(zhì)酶原核表達(dá)載體。提取家蠶蠶蛹RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,利用設(shè)計好的PCR引物通過RT-PCR得到幾丁質(zhì)酶的基因片段,并將其與載體pET-28

5、a連接,構(gòu)建表達(dá)載體。結(jié)果顯示:通過RT-PCR得到的幾丁質(zhì)酶的基因片段的核酸序列與數(shù)據(jù)庫中的序列吻合,成功構(gòu)建家蠶蠶蛹幾丁質(zhì)酶原核表達(dá)載體。為家蠶蠶蛹過敏原幾丁質(zhì)酶的重組表達(dá)和免疫活性鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.家蠶蠶蛹過敏原蛋白熱休克蛋白20.8的克隆、表達(dá)、純化與免疫學(xué)活性鑒定:通過分子生物學(xué)的方法得到的重組過敏原蛋白,可以被應(yīng)用于過敏診斷和免疫治療。本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诘玫骄哂忻庖邔W(xué)活性的熱休克蛋白20.8重組蛋白。提取家

6、蠶蠶蛹RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,利用設(shè)計好的PCR引物通過RT-PCR得到熱休克蛋白的基因片段,并將其與載體pET-28a連接,構(gòu)建表達(dá)載體。進(jìn)一步通過IPTG誘導(dǎo)得到熱休克蛋白的重組蛋白,用Ni2+親和層析柱進(jìn)行分離,將得到的蛋白與家蠶蠶蛹過敏病人血清反應(yīng),以檢測其免疫學(xué)活性。結(jié)果顯示:通過RT-PCR得到的熱休克蛋白的基因片段的核酸序列與數(shù)據(jù)庫中的序列吻合；通過構(gòu)建表達(dá)載體和IPTG誘導(dǎo)得到了重組的熱休克蛋白20.8,且其具有免疫