蛋白質(zhì)純化膠體過(guò)濾法

1、不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過(guò)濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊(cè)，GelFiltration）。儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn1.6100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollect需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機(jī)（低速5000rpm）；濃縮用離心管Centriprep30（Amicon4322）請(qǐng)注意其使用方法藥品試

2、劑：膠體SephacrylS300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA150平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場(chǎng)所的溫度一致，否則溫度變化會(huì)產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。BufferA150:注意使用時(shí)的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合（BioRad151

3、1901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1350）方法步驟：管柱裝填：1）以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可，嚴(yán)禁使用試管刷）；并請(qǐng)了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA150試看

4、管路是否通暢；可以用止血鉗或長(zhǎng)尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進(jìn)行。注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng)，不要裝置于交通要沖。2）依預(yù)估量取出Sephacryl膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。3）在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開(kāi)始流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上方的液面逐漸降低時(shí)，可于頂端添加膠體，以達(dá)所要高度；膠體高度約90cm.4）膠體

5、完全沈降后，小心以bufferA150加滿管柱，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開(kāi)出口以重力流洗。調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5mLtube.5）膠柱流洗約100mL后，關(guān)閉出口，拆開(kāi)頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高，注意勿破壞膠體表面平整；然后打開(kāi)出口，使液面下降至膠體面，再關(guān)閉出口，準(zhǔn)備注入樣本。樣本色析進(jìn)行：6）以微量移液器或滴管吸取樣本（樣本體積不得超過(guò)膠體總體積的3%

6、），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面！（樣本確實(shí)體積_______mL）實(shí)驗(yàn)材料SephacrylS300膠體試劑、試劑盒緩沖液bufferA150儀器、耗材色析管柱鐵夾試管鐵架水平儀收集器濃縮用離心機(jī)濃縮用離心管實(shí)驗(yàn)步驟一、儀器設(shè)備色析管柱（PharmaciaCcolumn1.6100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollect需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機(jī)（低速5000rpm）

7、；濃縮用離心管Centriprep30（Amicon4322）請(qǐng)注意其使用方法。二、藥品試劑膠體SephacrylS300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA150平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場(chǎng)所的溫度一致，否則溫度變化會(huì)產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。Buf

8、ferA150:注意使用時(shí)的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合（BioRad1511901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1350）三、管柱裝填1.以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可，嚴(yán)禁使用試管刷）；并請(qǐng)了解管柱的

9、構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA150試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長(zhǎng)尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進(jìn)行。注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng)，不要裝置于交通要沖。2.依預(yù)估量取出Sephacryl膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。3.在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開(kāi)始流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上

10、方的液面逐漸降低時(shí)，可于頂端添加膠體，以達(dá)所要高度；膠體高度約90cm。4.膠體完全沈降后，小心以bufferA150加滿管柱，關(guān)閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開(kāi)出口以重力流洗。調(diào)整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5mLtube。5.膠柱流洗約100mL后，關(guān)閉出口，拆開(kāi)頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高，注意勿破壞膠體表面平整；然后打開(kāi)出口，使液面下降至膠體面，再關(guān)閉出口，準(zhǔn)備注入樣本