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1、實驗報告實驗報告實驗名稱:實驗名稱:蛋白質(zhì)含量的測定(Folin酚法)實驗日期:實驗日期:班級:班級:學(xué)生姓名學(xué)生姓名:研究背景與目的:研究背景與目的:蛋白質(zhì)是生物最重要的基本組成成份之一蛋白質(zhì)的定量分析方法的研究在國際上一直十分活躍,F(xiàn)olin酚法是一種靈敏度極高,可快速測定蛋白質(zhì)含量的方法,廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。本實驗培養(yǎng)掌握使用Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法,同時熟練722分光光度計的使用和比色法。實驗原理:
2、實驗原理:Folin試劑是由兩部分組成,甲試劑相當于雙縮脲試劑,在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成絡(luò)合物。試劑乙是磷鎢酸和磷鉬酸的混合液,在堿性條件下極不穩(wěn)定,易被蛋白質(zhì)和試劑甲生成的絡(luò)合物還原,生成鉬藍和鎢藍混合物而呈藍色反應(yīng)。根據(jù)此試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)以及一定條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比,可用比色法,使用分光光度計,通過對呈現(xiàn)藍色的混合物進行濃度測定,再依據(jù)比例計算出蛋白質(zhì)含量。儀器與試劑:儀器與試劑:722分光光度計(
3、上海精密科學(xué)儀器有限公司)架盤天平具塞刻度試管8支15ml移液器100ul1000ul和1ml5ml容量瓶50ml1小燒杯漏斗研缽Folin酚試劑:試劑甲試劑乙250ugml牛血清白蛋白標準原液材料:材料:綠豆芽下胚軸實驗步驟:實驗步驟:1標準曲線的繪制取6支15ml具塞刻度試管,編號。如下表所列加入相應(yīng)試劑。管號管號123456蛋白質(zhì)含蛋白質(zhì)含量(ugml)050100150200250加原液量加原液量(ml)00.20.40.60.
4、81.0加dH2O量(ml)1.00.80.60.40.20步驟一步驟一各加入試劑甲各加入試劑甲5ml,混合后在室溫下放置,混合后在室溫下放置10分鐘分鐘步驟二步驟二各加入試劑乙各加入試劑乙0.5ml立即混合均勻(速度要快)立即混合均勻(速度要快),放置半小時,放置半小時步驟三步驟三以不含蛋白質(zhì)的以不含蛋白質(zhì)的1號試管為對照,與其他號試管為對照,與其他5支試管內(nèi)的溶液依次用支試管內(nèi)的溶液依次用722分光光度計于光光度計于650nm波長下
5、比色,記錄各試管內(nèi)溶液的消光值。波長下比色,記錄各試管內(nèi)溶液的消光值。以消光值為縱坐標,以牛血清白蛋白含量(ugml)為橫坐標,繪制標準曲線。2樣品測定(1)稱取綠豆芽下胚軸1g于研缽中,勻漿。轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中,定容。然后過思考題:思考題:1為什么要求加入試劑乙后立即混勻?否則將會如何影響測定結(jié)果?已知試劑乙未磷鎢酸和磷鉬酸混合液,乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定,在堿性條件下極不穩(wěn)定。又知Folin-酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成
6、堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液,所以加入試劑乙后要立即混勻,以便在在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前,使還原反應(yīng)發(fā)生。否則試劑乙含量減少,使得蛋白質(zhì)與試劑甲作用后的溶液不能完全反應(yīng),以致所測蛋白質(zhì)含量偏低。2試分析本實驗方法中的干擾因素本實驗方法中從物質(zhì)角度分析蛋白質(zhì)中氨基酸的R基團中的酚類物質(zhì),豆芽中的檸檬酸、甘氨酸、各種糖以及各種還原劑等對測定均有干擾作用。從實驗過程分析,反應(yīng)的操作時間不易控制,如:加入試劑乙后迅速混勻等。3為什么測定同一類甚至
7、同一種物質(zhì)的含量會有多種測定方法?每一種測量方法都有各自的特點,即各有各的優(yōu)缺點,如:Bradfd法和Lowry法靈敏度最高,定氮法更準確,但也更加復(fù)雜。因為某一種并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)含量測定,于是,我們在選擇測量方法時,要考慮實驗對測定所要求的靈敏度和精確度,蛋白質(zhì)性質(zhì),溶液中存在的干擾因素,測定所要花費的時間等等方面。所以會有多種測定方法。4在Folin酚法中,試劑甲的作用是什么?試劑甲的作用是與蛋白質(zhì)中的肽鍵形
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