人扭轉(zhuǎn)蛋白A的基因克隆表達(dá)及蛋白質(zhì)純化.pdf

1、原發(fā)性扭轉(zhuǎn)痙攣是一組由于軀干、肢體、頸部或顏面肌肉協(xié)調(diào)功能失調(diào)而出現(xiàn)各種姿勢的異常或肢體的扭轉(zhuǎn),已有14種類型的扭轉(zhuǎn)痙攣被定位.常染色體顯性早發(fā)性扭轉(zhuǎn)痙攣定位于9<,q>34,是一種最常見、最為嚴(yán)重的扭轉(zhuǎn)痙攣,1989年Ozelius等將該基因命名為DYT1,1997年又克隆出該基因,它編碼332個氨基酸組成的DYT1扭轉(zhuǎn)蛋白A(TorsinA),該蛋白是腺苷三磷酸酶AAA家族的成員,一種ATP結(jié)合蛋白,它與許多細(xì)胞活動有關(guān).DYT1基

2、因突變可引起9<,q>連鎖的扭轉(zhuǎn)痙攣.在實(shí)驗(yàn)中,本文從人扭轉(zhuǎn)蛋白A的編碼序列中設(shè)計(jì)引物,以人肝cDNA文庫作模板,成功地?cái)U(kuò)增到編碼DYT1蛋白的基因片段,該片段全長939 bp.將所得片段與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌中,從轉(zhuǎn)化平板上挑出菌落,用堿裂法提取質(zhì)粒,通過PCR和酶切分析,成功地篩選到陽性克隆,測序結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致.提取質(zhì)粒,用BamH I和Xho I酶切,回收目的片段,分別克隆到原核表達(dá)載體pET2

3、8a(+)和pGEX-6P-1中,轉(zhuǎn)化JM109受體菌,從JM109受體菌中提出質(zhì)粒,再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌中,篩選出陽性克隆,成功地構(gòu)建了人扭轉(zhuǎn)蛋白A原核表達(dá)載體.在pET28a(+)中表達(dá)的DYT1蛋白為包含體(IBS),經(jīng)過IBS制備、蛋白質(zhì)復(fù)性、金屬螯合層析純化、Superdex 75凝膠過濾純化,得到了純的DYT1蛋白;在pGEX-6P-1中表達(dá)的DYT1蛋白與GST的融合蛋白也為IBS,但此融合蛋白復(fù)性不好,只得到極少