小麥木聚糖酶抑制蛋白的親和純化及抑制蛋白基因的克隆與表達(dá).pdf

1、木聚糖酶抑制蛋白抑制木聚糖酶催化水解木聚糖，給木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用帶來(lái)了不便，另外它在植物防御致病菌以及害蟲侵害的過(guò)程中也擔(dān)任重要角色。木聚糖抑制蛋白中的XIP型抑制蛋白與幾丁質(zhì)酶在進(jìn)化上存在一定的關(guān)系，并且?guī)锥≠|(zhì)酶家族中有些不活躍的幾丁質(zhì)酶具有木聚糖酶抑制活性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)酶-抑制蛋白的相互作用，采用固定化木聚糖酶親和純化的方法從小麥品種小偃22子粒的粗蛋白浸提液中親和純化出木聚糖酶抑制蛋白，并從小偃22總DNA中克隆得到一段基因

2、，使其在大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)異源表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如下：
　　(1)3％戊二醛交聯(lián)16h，固定化酶小球的回收率37.8%，固定化酶親和吸附48h，固定化木聚糖酶親和吸附木聚糖酶抑制蛋白的吸附率為47.88%。親和純化得到的蛋白溶液其木聚糖酶抑制蛋白的抑制率為60.65%，最適抑制溫度為30℃，最適抑制pH為7.0。
　　(2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)組前期得到的野生型木聚糖抑制蛋白的N端序列SVSSVVS,進(jìn)行

3、序列比對(duì)，設(shè)計(jì)引物，提取小麥總DNA，PCR擴(kuò)增出大小合適的核酸片斷，TA克隆，提取質(zhì)粒測(cè)序。通過(guò)序列對(duì)比，從克隆得到的眾多基因序列中選取出現(xiàn)概率較高的與NCBI上的AY973230.1基因序列完全一致且與幾丁質(zhì)酶基因有很高同源性的基因作為研究對(duì)象。
　　(3)目的基因在大腸桿菌中28℃誘導(dǎo)5h收集菌體超聲破碎，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，在破碎上清中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大小合適的蛋白，在破碎沉淀中發(fā)現(xiàn)大小合適的蛋白，推測(cè)可能誘導(dǎo)的蛋白形成了不

4、溶性的包涵體，改變誘導(dǎo)條件，使目的基因在大腸桿菌中16℃過(guò)夜誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)，在破碎上清中發(fā)現(xiàn)大小合適的可溶性蛋白，表達(dá)蛋白純化后的濃度為770μg/ml，但是經(jīng)活性測(cè)定，表達(dá)的蛋白沒(méi)有木聚糖抑制活性，并且也幾乎沒(méi)有幾丁質(zhì)酶活性。
　　(4)該基因在畢赤酵母中用0.5%甲醇于28℃誘導(dǎo)誘導(dǎo)12h后出現(xiàn)目的蛋白，誘導(dǎo)84h后，目的蛋白在畢赤酵母中表達(dá)量大約為19.52mg/ml，但是表達(dá)的蛋白仍然檢測(cè)不到木聚糖酶抑制活性及