茶樹巰基蛋白酶抑制劑基因的克隆及表達分析.pdf

1、巰基蛋白酶抑制劑是廣泛存在于脊椎動物、昆蟲和植物體內(nèi)的一種對巰基蛋白酶活性有抑制作用的蛋白質(zhì)，植物來源的巰基蛋白酶抑制劑已從單子葉植物和雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)了30多種。植物巰基蛋白酶抑制劑參與種子休眠和萌發(fā)過程中內(nèi)源性蛋白酶活力的調(diào)節(jié)，可保護貯藏蛋白不被種子中的內(nèi)源巰基蛋白酶水解。植物巰基蛋白酶抑制劑還具有抑制某些病原微生物及某些昆蟲體內(nèi)蛋白酶的作用，是植物體的一種自然防御體系，保護植物免受真菌和昆蟲的侵襲。研究報道，將巰基蛋白酶抑制劑基因

2、轉(zhuǎn)化植物，可提高轉(zhuǎn)化植株對昆蟲和線蟲的抗性。植物蛋白酶抑制劑作為天然的抗蟲物質(zhì)在植物抗逆性基因工程中受到越來越多的重視。 本文以茶樹品種龍井43鮮葉為材料，根據(jù)巰基蛋白酶抑制劑的保守氨基酸序列設(shè)計簡并引物，利用RT-PCR和3'/5'RACE技術(shù)，首次克隆出茶樹巰基蛋白酶抑制劑基因(Teacystatin，簡稱TC)cDNA的全長序列。序列測定表明，TeacystatincDNA的全長序列為627bp，在起始密碼子上游有一個由8

3、7個堿基組成的5'非編碼區(qū)，在終止密碼子下游有一個由238個堿基組成的3'非編碼區(qū)，包括1個加poly(A)信號和一個長度為20個腺苷酸的poly(A)尾，開放閱讀框編碼101個氨基酸，分子量為11.06kDa。經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)Teacystatin的氨基酸序列與多數(shù)植物巰基蛋白酶抑制劑的氨基酸序列具有較高的同源性，同源性為70％～87％。該基因在推測的氨基酸序列中含有巰基蛋白酶抑制劑家族中高度保守的、與其活性有關(guān)的Gly6、QXV

4、XG(Q49V50V51S52G53)、A/PW(P79W80)結(jié)構(gòu)。RT-PCR分析表明，該基因在茶樹正常的不同組織中均有表達。 根據(jù)TeacystatincDNA編碼區(qū)序列設(shè)計引物，以茶樹鮮葉染色體基因組總DNA為模板進行PCR擴增，獲得由328bp組成的TeacystatinDNA片段，序列分析表明：Teacystatin基因DNA片段內(nèi)無內(nèi)含子序列。Southern雜交結(jié)果表明該基因以單拷貝的形式存在于染色體基因組中。此

5、基因的克隆，為深入研究Teacystatin基因結(jié)構(gòu)、表達和調(diào)節(jié)機制及其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系奠定了重要的基礎(chǔ)。 為了研究茶樹巰基蛋白酶抑制劑基因的功能，構(gòu)建了Teacystatin的原核表達載體。通過RT-PCR法擴增出TeacystatincDNA編碼區(qū)序列，將其定向克隆到表達載體pET-32a(+)上，得到重組質(zhì)粒pET-TC，在表達宿主菌BL21trxB(DE3)中高效表達，產(chǎn)生分子量約為31.8kDa的特異融合蛋白。實驗表明

6、：隨著誘導時間的延長，表達的融合蛋白Trx-TC的產(chǎn)量逐漸增加，特異蛋白的表達量最高可占菌體總蛋白的35.4％；在15℃、25℃、30℃和37℃四個不同誘導溫度下和IPTG終濃度在0.5～5mmol/L范圍內(nèi)均能誘導產(chǎn)生融合蛋白，表達的產(chǎn)物主要以可溶性蛋白形式存在。另外，體外酶促反應表明：表達的融合蛋白Trx-TC對木瓜蛋白酶有明顯的抑制活性，說明茶樹巰基蛋白酶抑制劑基因的表達產(chǎn)物能抑制活性中心含半胱氨酸殘基的蛋白酶的水解作用，因而具有

7、正常的生物學功能。且表達產(chǎn)物經(jīng)100℃高溫處理20min后，仍具有生物活性，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。 為了研究Teacystatin基因在利用基因工程技術(shù)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中的潛在價值，成功構(gòu)建了表達Teacystatin基因的植物表達載體pBI121-TC，通過農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法，將其導入煙草中，在誘導生根移栽后對轉(zhuǎn)化的煙草植株進行了一系列的分子檢測。PCR和SouthernBlot檢測表明Teacystatin基因已整合到