蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein）是存在于前體蛋白中的一段氨基酸序列，它能夠發(fā)生自我剪切，并通過肽鍵將兩端的蛋白質(zhì)外顯子（N端外顯子N-extein, C端外顯子C-extein）連接起來，形成成熟蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以分為三類，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子（canonical intein），微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子（mini intein）和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子（split intein）。其中，前兩種蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)蛋白質(zhì)順式剪接（ protei

2、n cis-splicing），斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子被斷裂成兩部分，N端蛋白質(zhì)內(nèi)含子（IN, N-intein）和C端蛋白質(zhì)內(nèi)含子（IC，C-intein），分別位于兩個(gè)閱讀框架中，介導(dǎo)蛋白質(zhì)反式剪接(protein trans-splicing)。
　　蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)研究、蛋白質(zhì)工程及其它領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，例如，蛋白質(zhì)內(nèi)含子已應(yīng)用于毒素蛋白的合成，目的蛋白的活性控制，基因治療，蛋白質(zhì)修飾、標(biāo)記，蛋白質(zhì)環(huán)化，蛋白質(zhì)純化等方面。本論

3、文主要涉及蛋白質(zhì)內(nèi)含子通用性研究及應(yīng)用。前四部分為蛋白質(zhì)內(nèi)含子通用性研究，后三部分為應(yīng)用。分別為，蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX在臨近外顯子中存在脯氨酸時(shí)的剪接研究；蛋白質(zhì)內(nèi)含子 Ssp DnaX在剪接困難序列（KSCDKTH）中的剪接研究；定向進(jìn)化提高蛋白質(zhì)內(nèi)含子 Ter ThyX剪接活性的研究；進(jìn)化前后蛋白質(zhì)內(nèi)含子 Cne PRP8-S0及Cne PRP8-E-S0的比較研究；基于兩個(gè)純化標(biāo)簽的雙純化系統(tǒng)的應(yīng)用；蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接蓖麻毒

4、蛋白的應(yīng)用；蛋白質(zhì)內(nèi)含子對滌綸織物抗靜電整理的應(yīng)用。本論文主要研究內(nèi)容包括：
　　1.在pMST系統(tǒng)中篩選三個(gè)剪接活性高的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX, Ter DnaE-3和 Npu DnaE，將+2位突變?yōu)楦彼峄蛘邔?1位和+2位同時(shí)突變?yōu)楦彼?檢測蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Ssp DnaX微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接效率為100％。進(jìn)一步將Ssp DnaX斷裂成不同的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子（S0, S1, S11）

5、，在體內(nèi)（in vivo）和體外（in vitro）檢測其剪接活性。當(dāng)+2位或-1位和+2位同時(shí)為脯氨酸時(shí)，Ssp DnaX-S1/S11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體內(nèi)外都能夠發(fā)生高效剪接。本文首次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)臨近外顯子中有脯氨酸時(shí)， Ssp DnaX的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子和S1/S11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子能夠高效剪接，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)使得蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接不再受到脯氨酸的限制，可以將蛋白質(zhì)內(nèi)含子應(yīng)用于含有脯氨酸的宿主蛋白中，同時(shí)為Ssp DnaX三維結(jié)構(gòu)的研究提

6、供了有用信息。
　　2.將 pMST中蛋白質(zhì)內(nèi)含子插入位點(diǎn)處的外顯子突變?yōu)镵SCDKTH序列，選用具有高剪接活性的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子 Ssp DnaX-S0/S1/S11和Ter ThyX-S0/S1/S11在pMST系統(tǒng)中嘗試剪接。研究結(jié)果表明， Ssp DnaX-S0/S1/S11在體內(nèi)外都有很高的剪接效率（~100%）。這一發(fā)現(xiàn)使蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用不再受KSCDKTH序列的限制，也為抗體的剪接合成提供可行性基礎(chǔ)。
　　3

7、.在pKH系統(tǒng)中(卡那霉素抗性系統(tǒng))，通過定向進(jìn)化將Ter ThyX微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性提高到~100%，而且在三個(gè)位點(diǎn)都有100%剪接活性，說明獲得的Ter ThyX不僅剪接活性提高，通用性也有所提高。定向進(jìn)化是一種提高蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的簡便、有效的方法，通過簡單的隨機(jī)突變及定向篩選獲得高效剪接及通用性高的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，可以高效剪接含有不同外顯子序列的目的蛋白。同時(shí)可以通過DNA測序得知蛋白質(zhì)內(nèi)含子的突變氨基酸，將結(jié)果反饋到蛋白

8、質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與剪接活性關(guān)系的研究中。
　　4.在pMST系統(tǒng)中，將定向進(jìn)化前后的S0型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Cne PRP8-S0（天然+1位為Ser）和Cne PRP8-E-S0（天然+1位為Ser）進(jìn)行剪接效率、剪接動力學(xué)（+1位為Ser或Cys）以及N-cleavage和C-cleavage的比較研究。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)化后的Cne PRP8-E-S0比天然Cne PRP8-S0在剪接速率和剪接活性方面都更加優(yōu)越，尤其是將天然+1位Se

9、r突變?yōu)镃ys時(shí)，Cne PRP8-E-S0表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。天然Cne PRP8-S0和進(jìn)化后Cne PRP8-E-S0的N-cleavage差別不大，而對于C-cleavage效率和速率，Cne PRP8-E-S0更占優(yōu)勢。本文通過比較天然Cne PRP8-S0及進(jìn)化后Cne PRP8-E-S0，發(fā)現(xiàn)通過定向進(jìn)化可以獲得具有功能優(yōu)勢的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，獲得的Cne PRP8-E-S0不僅可以剪接更多的目的蛋白，而且由于其高效的C-cl

10、eavage速率和效率，還可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)內(nèi)含子斷裂反應(yīng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化中。此外，定向進(jìn)化獲得的 Cne PRP8-E-S0比具有優(yōu)越性能的天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Npu DnaE更具優(yōu)勢（Cne PRP8-E-S0在+1位突變?yōu)榉翘烊话被釙r(shí)仍可高效剪接，而Npu DnaE剪接活性降低）。
　　5.本文設(shè)計(jì)了一個(gè)雙純化方法，將SUMO純化標(biāo)簽與Ssp GyrBS11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子聯(lián)用，構(gòu)建一個(gè)雙純化系統(tǒng)。雙純化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)為，His

11、6-SUMO標(biāo)簽位于目的蛋白質(zhì)的N端，Ssp GyrB S11N-CBD標(biāo)簽位于目的蛋白的 C端，目的蛋白在整個(gè)融合蛋白的中間位置。研究結(jié)果表明，通過對麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）和硫氧還蛋白（Trx）進(jìn)行雙純化，在6種誘導(dǎo)條件下，均得到了純度高的MBP（純度>95%，2.5-5 mg/L）和Trx（純度>95%，4-8 mg/L），而且電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）檢測雙純化得到的 Trx蛋白分子量的結(jié)果表明，經(jīng)過雙純化的目的蛋白沒有末端

12、缺失，也沒有標(biāo)簽殘留。通過雙純化系統(tǒng)可以純化得到高純度的目的蛋白，同時(shí)解決了目的蛋白末端缺失的問題，用雙純化方法得到的蛋白質(zhì)，可以應(yīng)用于對蛋白質(zhì)要求較高的研究中，例如，蛋白質(zhì)組學(xué)研究。同時(shí)，雙純化系統(tǒng)的提出，也使蛋白質(zhì)純化方法上升到一個(gè)新高度，一次性解決目的蛋白純度及末端缺失的問題。
　　6.蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以用于毒素蛋白的生產(chǎn)，本研究分為兩部分。第一部分，改造RicinA（突變氨基酸），使其為蛋白質(zhì)內(nèi)含子的高效剪接提供基礎(chǔ)，并通過

13、 RicinA蛋白量與毒性關(guān)系曲線，檢測三種突變體是否仍然具有毒性。第二部分，在 RicinA中選取兩個(gè)不同插入位點(diǎn)site1, site2，不改變外顯子氨基酸殘基（即不改變RicinA的氨基酸），檢測Cne PRP8E-S0斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性。研究結(jié)果，第一部分，獲得RicinA蛋白量與毒性關(guān)系曲線圖以及改造后RicinA毒性的檢測方法，經(jīng)檢測，三個(gè)突變體都沒有失去毒性。第二部分，發(fā)現(xiàn)Cne PRP8E-S0在位點(diǎn)site2處

14、有輕微剪接活性（～31%）。本研究為蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體外高效剪接 RicinA提供了一定的基礎(chǔ)，也證明利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接RicinA實(shí)現(xiàn)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的可行性。
　　7.蛋白質(zhì)內(nèi)含子用于滌綸織物抗靜電整理。滌綸織物由于其耐穿、易洗滌等優(yōu)良性能，被廣泛應(yīng)用于服裝等領(lǐng)域。但是其分子結(jié)構(gòu)中缺少親水基團(tuán)，因而具有親水性差、易產(chǎn)生靜電等缺點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接功能將麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）與硫氧還蛋白(Trx)剪接形成的親水性融