新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子體外剪接動(dòng)力學(xué)的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein）是鑲嵌在宿主蛋白質(zhì)中的插入序列，在宿主蛋白質(zhì)成熟過(guò)程中能夠自我剪切下來(lái)，同時(shí)將兩側(cè)的序列-蛋白質(zhì)外顯子（exteins）通過(guò)肽鍵相連接，形成成熟的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的這一成熟過(guò)程被稱為蛋白質(zhì)順式剪接（proteincis-splicing）。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子（split-intein）是在蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部區(qū)域特定位點(diǎn)發(fā)生斷裂，形成N-端蛋白(IN)和C-端蛋白(IC)，分別由基因組上相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（op

2、enreadingframe，ORF）編碼。在翻譯后成熟過(guò)程中，IN和IC相互識(shí)別，重建催化活性中心，介導(dǎo)蛋白質(zhì)反式剪接(proteintrans-splicing)。
　　 通過(guò)人工改造斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂位點(diǎn)，使之靠近蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-末端或C-末端，即形成了新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)在蛋白質(zhì)純化、基因治療、環(huán)狀多肽制備以及大分子復(fù)雜蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方面已取得了一些成果。新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

3、在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大了斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用，提供了在目的蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端標(biāo)記任意化學(xué)基團(tuán)的潛力。在進(jìn)行應(yīng)用之前需要對(duì)這一反應(yīng)的酶促動(dòng)力學(xué)進(jìn)行全面的了解，因而，新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接動(dòng)力學(xué)的研究顯得十分重要。
　　 本課題選取新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11進(jìn)行剪接動(dòng)力學(xué)的研究。本研究中S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端僅含有11個(gè)氨基酸，S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端僅含有6個(gè)氨基酸，易

4、于化學(xué)合成，可以應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)或藥物的N-末端或C-末端熒光素、生物素等標(biāo)記。
　　 構(gòu)建只含有N端前體蛋白或C端前體蛋白相應(yīng)序列的表達(dá)質(zhì)粒，麥芽糖結(jié)合蛋白(maltosebindingprotein，MBP)與IN組成的融合蛋白為N端前體蛋白;Ic與硫氧還蛋白(thioredoxin，T)組成的融合蛋白為C端前體蛋白。利用N端前體蛋白帶有的MBP標(biāo)簽可以與Amyloseresin特異性結(jié)合，C端前體蛋白帶有的6×組氨酸標(biāo)簽可

5、以與Ni-NTAresin特異性結(jié)合，純化得到用于后續(xù)體外反應(yīng)所需的N端前體蛋白和C端前體蛋白。
　　 將純化的N端前體蛋白與C端前體蛋白在摩爾比為1∶1的條件下進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)Western印跡檢測(cè)剪接反應(yīng)的活性，結(jié)果表明，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11在體外均有剪接活性。將N端前體蛋白和C端前體蛋白兩兩組合進(jìn)行體外交叉反應(yīng)，除TX-S1N/SX-S1C組合外，其它組合均無(wú)交叉反應(yīng)，為同時(shí)使

6、用多個(gè)斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子對(duì)一個(gè)目的蛋白進(jìn)行多段標(biāo)記或?qū)Χ鄠€(gè)目的蛋白進(jìn)行標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。在不同的DTT的濃度、溫度、氯化鈉的濃度和pH值條件下，探索斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接的最優(yōu)化條件，結(jié)果表明，除反應(yīng)體系中無(wú)DTT存在時(shí)，剪接效率明顯下降甚至無(wú)剪接反應(yīng)發(fā)生以外，其余條件對(duì)剪接反應(yīng)影響較小。
　　 當(dāng)N端前體蛋白與C端前體蛋白摩爾比為10∶1混合時(shí)，動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S1

7、1體外剪接效率分別達(dá)到～96％、～50％、～93％和～87％，剪接速率常數(shù)分別為(2.68±0.39)×10-4s-1、(2.19±0.33)×10-3s-1、(3.94±0.91)×10-4s-1和(3.43±0.59)×10-4s-1。
　　 新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在位點(diǎn)特異性蛋白標(biāo)記的潛在應(yīng)用，使蛋白質(zhì)標(biāo)記不再局限于傳統(tǒng)的氨基酸特異性標(biāo)記。新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子將在蛋白質(zhì)工程、蛋白質(zhì)藥物開(kāi)發(fā)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究等方面有非常廣