蛋白質(zhì)內(nèi)含子溶液結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及藥物靶點(diǎn)作用.pdf

1、本論文涉及蛋白質(zhì)內(nèi)含子(Intein)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、溶液性質(zhì)以及intein作為藥物靶點(diǎn)的研究工作，研究?jī)?nèi)容主要分為三個(gè)部分：1）結(jié)核分支桿菌RecAmini-intein的溶液結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。研究發(fā)現(xiàn)，盡管關(guān)鍵氨基酸殘基的突變影響了蛋白質(zhì)的剪接活性，但是氨基酸突變對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響不大，這一結(jié)果與晶體結(jié)構(gòu)研究的結(jié)論相似。蛋白質(zhì)溶液性質(zhì)的核磁共振研究表明V67L突變使RecAmini-intein的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，D121G突變明顯影響由D

2、121側(cè)鏈構(gòu)建的氫鍵網(wǎng)，從而影響RecAintein的蛋白質(zhì)剪接與C端的斷裂活性。2）集胞藻PCC6803DnaEsplitintein的N端剪接域的溶液性質(zhì)以及N端與C端剪接域的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)N端剪接域在溶液中表現(xiàn)出典型的內(nèi)在無序蛋白質(zhì)性質(zhì)，盡管仍有少量的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在。NMR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C端剪接域加入后明顯促進(jìn)了N端剪接域的折疊，同時(shí)體內(nèi)共表達(dá)實(shí)驗(yàn)亦表明C端與N端剪接域之間的共折疊，隨后利用SPR測(cè)定兩者間的相互作用。3）inte

3、in潛在的抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)作用與金屬化合物抑制intein剪接。研究結(jié)果表明抑制intein剪接可以有效的阻止結(jié)核菌的生長(zhǎng)，鉑配合物要比其它金屬化合物表現(xiàn)出更好的抑制效果，獲得了結(jié)構(gòu)/活性之間的關(guān)系，在所有實(shí)驗(yàn)的化合物中順鉑表現(xiàn)出最好的抑制效果。
　　 第一章是對(duì)intein即蛋白質(zhì)內(nèi)含予的綜述，主要涉及intein與蛋白質(zhì)剪接的概念、intein的分布與基因遷移、intein的保守基序、inteln的類型、intein的剪接機(jī)理

4、、intein的三維結(jié)構(gòu)及intein的應(yīng)用。內(nèi)容包括本論文涉及的順式剪接和反式剪接，即由連續(xù)、完整的基因序列所編碼的順式intein誘導(dǎo)的剪接過程和兩個(gè)分裂的基因序列所編碼的反式intein誘導(dǎo)的剪接過程。
　　 第二章是關(guān)于結(jié)核分支桿菌RecAmini-intein的溶液結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)研究。我們通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法獲得了15N和/或13C-標(biāo)記的RecAmini-intein，隨后利用核磁共振方法解析V67L突變體(spli

5、cingmutant，SM)和D121G/V67L突變體(cleavagemutant，CM)的溶液結(jié)構(gòu)及這兩個(gè)蛋白質(zhì)與CM139_V67的溶液動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通過溶液結(jié)構(gòu)與晶體結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)主鏈構(gòu)象沒有明顯差異，屬于典型的HINT折疊結(jié)構(gòu)。通過氫氘交換實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)V67L突變?cè)鰪?qiáng)RecAintein整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。D121G突變抑制了N端的斷裂活性，但促進(jìn)了C端的斷裂活性，利用氫氘交換、組合化學(xué)位移干擾研究表明D12

6、1G突變破壞了由D121側(cè)鏈構(gòu)建的氫鍵網(wǎng)，因此降低了蛋白質(zhì)剪接效率，同時(shí)由于C端失去氫鍵的約束，所以D121G突變?cè)斐蒀端的斷裂活性增強(qiáng)。
　　 第三章是關(guān)于集胞藻PCC6803DnaEsplitintein的溶液性質(zhì)及N端(123aa)與C端(36aa)剪接域的相互作用研究。反式蛋白質(zhì)剪接與順式蛋白質(zhì)剪接的不同在于前者需要intein的剪接域即N端與C端相互結(jié)合以后才能發(fā)生蛋白質(zhì)剪接，因此N端與C端剪接域的分子識(shí)別與結(jié)合過程必

7、然影響到反式intein的剪接能力與剪接效率。我們通過基因重組分別得到DnaE-N123、DnaE-C36、共表達(dá)DnaE-N123-C36復(fù)合蛋白質(zhì)，在生理?xiàng)l件下DnaE-N123的圓二色譜數(shù)據(jù)表明N端剪接域趨向無結(jié)構(gòu)，但殘留有部分二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)隨著變性劑（尿素和鹽酸胍）的加入而逐漸失去。蛋白質(zhì)的變溫實(shí)驗(yàn)、凝膠過濾色譜與動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)證實(shí)N端剪接域的內(nèi)在無序性。生物信息學(xué)方法分析N端剪接域的序列顯示它處于無序和有序蛋白的分界范

8、圍，當(dāng)將C端剪接域的序列加入后就移動(dòng)到有序蛋白質(zhì)區(qū)域，這一預(yù)測(cè)得到了實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。核磁共振實(shí)驗(yàn)顯示單獨(dú)的N端剪接域的15N-1H相關(guān)譜(HSQC)分散性很差，表現(xiàn)出典型的無折疊蛋白質(zhì)的化學(xué)位移分布，但加入C端剪接域后，顯著提高了HSQC譜的信號(hào)分散，表現(xiàn)出折疊良好的蛋白質(zhì)行為。表面等離子體共振和等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)獲得了N端與C端剪接域的結(jié)合能力為微摩爾級(jí)。這些現(xiàn)象顯示N端與C端剪接域相互作用后蛋白質(zhì)發(fā)生了構(gòu)象變化，表明intein的反式剪

9、接需要有蛋白質(zhì)的正確識(shí)別、結(jié)合與折疊的過程，而這一過程必然受到溶液條件的影響(pH、溫度等)，從而影響反式蛋白質(zhì)剪接的效率，為調(diào)控蛋白質(zhì)剪接提供了條件。
　　 第四章是關(guān)于以結(jié)核分支桿菌RecAintein為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物研究?；隗w外綠色熒光蛋白和大腸桿菌體內(nèi)TS篩選體系發(fā)現(xiàn)，順鉑對(duì)RecAintein剪接活性有非常明顯的抑制效果，并且對(duì)結(jié)核菌也有明顯的抑制效果。質(zhì)譜、核磁共振實(shí)驗(yàn)以及細(xì)菌體內(nèi)的突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RecAint