蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的純化系統(tǒng)的優(yōu)化及其在生物傳感器中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子是存在于前體蛋白中的一段內(nèi)含肽，它通過蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)將兩端外顯子通過天然肽鍵相連接。通過突變蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接過程中的保守氨基酸，剪接型的蛋白質(zhì)內(nèi)含子可轉(zhuǎn)變?yōu)閿嗔研偷鞍踪|(zhì)原件。例如，將N端首位保守的Cys變成Ala后，蛋白質(zhì)內(nèi)含子就變成C端斷裂元件?；诘鞍踪|(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)和突變后的斷裂反應(yīng)，蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)工程中有著廣泛的應(yīng)用，例如在蛋白質(zhì)純化、分子開關(guān)、生物傳感器、蛋白質(zhì)標(biāo)記等領(lǐng)域。本論文主要圍繞蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)

2、純化和生物傳感器兩個方面的應(yīng)用展開相關(guān)研究。
　　將斷裂型的蛋白質(zhì)內(nèi)含子與蛋白純化標(biāo)簽相融合，則可產(chǎn)生自我斷裂蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽。利用斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的自我斷裂標(biāo)簽，迄今已有超過百余種蛋白成功得到純化，使用的融合標(biāo)簽包括:常規(guī)的層析標(biāo)簽和新型的非層析標(biāo)簽。但基于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的自我斷裂標(biāo)簽在應(yīng)用過程中還存在著諸多問題:蛋白質(zhì)內(nèi)含子的體內(nèi)提前斷裂和蛋白質(zhì)內(nèi)含子對目的蛋白的選擇性就是這些問題中的比較突出的兩個。基于不同的目的蛋白和表達環(huán)境

3、，蛋白質(zhì)內(nèi)含子在細菌表達時的斷裂效率一般在10-80％，而在高等哺乳動物細胞中基本沒有完整的前體蛋白。另外，與蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接反應(yīng)一樣，蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂反應(yīng)對目的蛋白也有偏好性。例如MtuRecAΔI-CM對GFP蛋白就表現(xiàn)出比其它蛋白更低的斷裂活性，在室溫下25h后的斷裂效率僅60％（與ELP標(biāo)簽融合）。這些瓶頸將會極大限制蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中的應(yīng)用。
　　為解決蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體內(nèi)發(fā)生提前斷裂的難題，本論文采用了兩種

4、方法:斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子和Zn2+敏感型的蛋白質(zhì)內(nèi)含子。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子由于其結(jié)構(gòu)上的不完整性，導(dǎo)致功能喪失。但通過添加互補片段，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)和功能又可得到恢復(fù)。我們將ΔI-CM蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接結(jié)構(gòu)域分成兩段，分別與一個非層析標(biāo)簽ELP相融合。不含蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端的C端融合蛋白，由于結(jié)構(gòu)上的不完整型，因此不具備C端斷裂活性。在體外通過添加其互補的N端融合蛋白，蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端的前體蛋白則可恢復(fù)斷裂活性。利用這一系統(tǒng)我們純化了

5、多個蛋白，且蛋白產(chǎn)量與全長蛋白質(zhì)內(nèi)含子系統(tǒng)相當(dāng)或更高。同時，我們實驗過程還發(fā)現(xiàn)通過一步法，即表達后的細胞在裂解之前混合并共同純化，最終獲得的蛋白產(chǎn)率明顯高于標(biāo)準的分步純化法。第二種斷裂型的蛋白質(zhì)內(nèi)含子是源于新型的S1型的SspDnaB蛋白質(zhì)內(nèi)含子。將缺少首11位氨基酸的SspDnaB蛋白質(zhì)內(nèi)含子引入到ELP-蛋白質(zhì)內(nèi)含子的非層析標(biāo)簽系統(tǒng)中。由于結(jié)構(gòu)上的缺失，缺少前11位氨基酸的SspDnaB蛋白質(zhì)內(nèi)含子在體內(nèi)不具有剪接活性。在體外通過添

6、加化學(xué)合成的互補首11位氨基酸小肽，蛋白質(zhì)內(nèi)含子可恢復(fù)斷裂活性。通過這種新型的斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子系統(tǒng)，我們成功的制備了多種模式蛋白并對它們的活性進行了測試。
　　在蛋白質(zhì)內(nèi)含子的晶體解析過程中，在靠近C端剪接區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個Zn2+的結(jié)合區(qū)域。之后實驗表明蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)和N端斷裂反應(yīng)都可被Zn2+抑制，且Zn2+的抑制作用又可通過添加金屬螯合劑消除，即可逆的。然而蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端斷裂反應(yīng)與剪接或N端斷裂反應(yīng)不完全相互依賴，Z

7、n2+對蛋白質(zhì)內(nèi)含子C端斷裂的抑制作用不如前兩者明顯。體外實驗表明，這是由于參與蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端斷裂的保守氨基酸與Zn2+的結(jié)合能力不夠強的原因造成的。這里我們通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法設(shè)計了多個金屬離子Zn敏感型的C端斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，并定性、定量分析了它們對Zn2+的敏感程度。實驗通過在MtuRecAΔI-CM蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端引入突變并與蛋白質(zhì)內(nèi)含子中參與C端斷裂反應(yīng)的His439共同組成Zn2+結(jié)合區(qū)域，然后在體外測試Zn2+對C端

8、斷裂反應(yīng)的抑制作用。這里共設(shè)計了6種不同的Zn2+敏感C端斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子突變體（分別命名為001，002，003，003b，004和004b），然后將這些突變體引入到常見的蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性評價模式蛋白MI-aFGF系統(tǒng)中，并對它們的Zn2+敏感性進行了篩選。研究發(fā)現(xiàn)在6個突變體中，突變體002由于體內(nèi)斷裂效率過高，以致體外無法獲得未斷裂前體，而另一突變體(001)在體內(nèi)外均不具備斷裂活性。在單劑量(1mM)實驗中，Zn2+對剩于4個

9、突變體以及野生型ΔI-CM的C端斷裂抑制效率均可達80％左右，且這一抑制效應(yīng)是可逆的。經(jīng)半最大效應(yīng)濃度(EC50)測試，發(fā)現(xiàn)003與野生型ΔI-CM對Zn離子敏感程度相當(dāng)，004對Zn離子的敏感程度比野生型提高了1倍，而03b與04b對Zn離子的敏感程度5倍高于其野生型。除此之外，我Zn2+敏感型03b和04b突變體斷裂速率也明顯快于野生型。
　　蛋白質(zhì)內(nèi)含子對目的蛋白的偏好性致使其對某些目的蛋白的斷裂效率較低，而這也極大地限制了

10、其在蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域中的應(yīng)用。我們通過對MtuRecAΔI-CM蛋白質(zhì)內(nèi)含子首位氨基酸進行20種氨基酸的突變，篩選得到一例以Gly為首位氨基酸的突變型(IG)蛋白質(zhì)內(nèi)含子。與野生型相比IG突變體更具通用性，且對溫度也更加敏感。當(dāng)與MBP標(biāo)簽相融合，在37℃下5小時內(nèi)IG突變體基本可完成先前系統(tǒng)中斷裂效率較慢的GFP斷裂反應(yīng)，而在同等條件下野生型的最終斷裂斷裂效率只有70％;在室溫或更低溫度條件下IG突變體與野生型斷裂效率卻相當(dāng)。當(dāng)與ELP

11、標(biāo)簽相融合，這一差異更加明顯。此外，我們還發(fā)現(xiàn)IG突變體在C端斷裂過程會產(chǎn)生一個由其末位Asn與-1位Lys或-3位Lys形成的酰胺鍵。將目的蛋白質(zhì)插入至蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部，利用這一特殊的側(cè)鏈反應(yīng)我們還制備了蛋白質(zhì)內(nèi)含子與目的蛋白的融合環(huán)肽。通過這種方法制備的融合環(huán)肽同樣具備其它環(huán)肽所具有的熱穩(wěn)定。經(jīng)過100℃孵育半小時后，蛋白上清中仍有10％的融合環(huán)化蛋白。
　　蛋白質(zhì)內(nèi)含子除了在蛋白質(zhì)純化中有著廣泛的應(yīng)用，蛋白質(zhì)內(nèi)含子對融合蛋白

12、的結(jié)構(gòu)還有穩(wěn)定性的作用。基于此，我們前期構(gòu)建了一系列的基于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的核荷爾蒙激素微生物傳感器，包括雌性激素（estrogen），甲狀腺激素(thyroid)等。這種荷爾蒙微生物傳感器是基于細菌生長表型，即只有當(dāng)配體與其受體結(jié)合時，細菌才可產(chǎn)生生長表型信號，且生長信號的強弱與配體和配體結(jié)合域的結(jié)合能力呈正相關(guān)關(guān)系，反之細胞則不能生長。與其它常規(guī)核荷爾蒙檢測系統(tǒng)相比，這種基于細菌生長表型的生物傳感器有著許多優(yōu)勢，包括:使用成本低、高通量

13、以及易于操作等。在這里我們利用之前構(gòu)建的甲狀腺激素微生物傳感器，研究了6個臨床發(fā)現(xiàn)的在甲狀腺激素配體結(jié)合區(qū)域中引起耐甲狀腺激素癥(Resistancetothyroidhormone)的突變對甲狀腺激素與受體結(jié)合的影響。研究表明，甲狀腺激素微生物傳感器不僅可以識別檢測甲狀腺激素化合物，同時還可以識別激素受體中的突變。這些突變在甲狀腺激素與其受體結(jié)合過程中的作用是不等同的:有些突變會讓配體結(jié)合域完全喪失配體結(jié)合能力，而另外一些則會讓配體結(jié)

14、合域部分喪失配體結(jié)合能力。通過測試它們的半最大效應(yīng)濃度測試(EC50)，我們定量分析了這些突變體對多個配體（包括天然與人工合成）與受體結(jié)合過程中影響狀況，所得到的突變體對配體結(jié)合過程中的相對影響與許多其它系統(tǒng)中的得到的數(shù)據(jù)相一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在這些突變體中的一個會使得配體結(jié)合域?qū)卓箘└用舾小?br>　　綜上所述，本研究論文優(yōu)化了現(xiàn)有的基于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的自我斷裂標(biāo)簽系統(tǒng)，且利用含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的細菌傳感器研究了人甲狀腺激素受體中的