N端無(wú)半胱氨酸斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的構(gòu)建及蛋白質(zhì)N端標(biāo)記的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的主要執(zhí)行者。在許多情況下，一個(gè)細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)是多個(gè)蛋白質(zhì)分子相互作用的結(jié)果。近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，對(duì)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)入了一個(gè)高速發(fā)展的階段。對(duì)它們的研究主要包括“體內(nèi)”和“體外”兩個(gè)方向。體外研究的重點(diǎn)是純化后的蛋白質(zhì)，將它們置于可控制的環(huán)境中，以期獲得它們的功能信息；而體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)著重于蛋白質(zhì)在細(xì)胞或者整個(gè)組織中的活性作用，從而可以了解蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的場(chǎng)所和相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 在體內(nèi)或

2、者體外的蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)修飾有利于幫助探究蛋白質(zhì)的生物功能和結(jié)構(gòu)功能。目前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的方法主要有各種化學(xué)方法和利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接進(jìn)行的標(biāo)記。前者大多數(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單易行，可是存在許多不足之處，如特異性不強(qiáng)，化學(xué)標(biāo)簽容易干擾被標(biāo)記蛋白的活性，蛋白濃度要求較高等；后者是一項(xiàng)新興的蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)，它雖然克服了化學(xué)標(biāo)記的不足可是目前仍有融合蛋白不穩(wěn)定、溶解性較差、活性低和通用性差等急需解決的問(wèn)題。本文在蛋白質(zhì)反式剪接的基礎(chǔ)上另辟蹊徑，

3、尋找內(nèi)部半胱氨酸較少的內(nèi)含子，對(duì)活性較高的內(nèi)含子我們利用定點(diǎn)突變、搭橋PCR等方法，構(gòu)建斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，獲得活性較高的N末端(整個(gè)intein內(nèi)部)無(wú)半胱氨酸的內(nèi)含子，并通過(guò)SDS-PAGE，Western Blot等方法檢測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性，然后利用實(shí)驗(yàn)室的TM系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子作為標(biāo)記手段的應(yīng)用潛質(zhì)。最后選擇合適的蛋白進(jìn)行N端特異性標(biāo)記。
　　 本課題選取蛋白質(zhì)內(nèi)含子TerNdse-2、TX-S1、HaVol Po

4、l、Msm DnaB-1、Arsp FB24和PP-PhiEL ORF40進(jìn)行蛋白質(zhì)N端標(biāo)記的研究。其中Msm DnaB和Arsp FB24為3型蛋白質(zhì)內(nèi)含子，其余均為常見(jiàn)的1型蛋白質(zhì)內(nèi)含子。TerNdse、TX-S1(C1/S)、HaVol Pol、Msm DnaB-1和Arsp FB24的一位氨基酸分別為絲氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸，這些intein內(nèi)部半胱氨酸也非常少，有利于定點(diǎn)突變和后續(xù)標(biāo)記的應(yīng)用。
　　 首先對(duì)這些蛋

5、白質(zhì)內(nèi)含子的原始剪接活性進(jìn)行檢測(cè)，在體內(nèi)pMTerNdse-2有微弱接活性，pMTX-S1(C1/S)有較高的剪接活性(本實(shí)驗(yàn)室已研究，體內(nèi)和體外均由較高的剪接活性)，pMHP的剪接活性為100％，pMMD(C1突變成S后)有微弱的剪接活性，pMAF沒(méi)有任何剪接活性。
　　 接著對(duì)pMTerNdse-2、pMTX-S1(C1/S)和pMHP進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變，將其內(nèi)部的所有半胱氨酸通過(guò)搭橋PCR突變成絲氨酸，同時(shí)將pMMD內(nèi)部的

6、C1恢復(fù)。通過(guò)Western Blot檢測(cè)它們的剪接活性。pMTerNdse-2、pMTX-S1(C1/S)和pMHP在半胱氨酸完全突變后沒(méi)有任何剪接活性，pMMD有非常高的剪接活性。
　　 對(duì)pMHP，將其內(nèi)部的四個(gè)半胱氨酸分別突變成絲氨酸，我們發(fā)現(xiàn)第二個(gè)半胱氨酸可以決定其剪接活性，利用定點(diǎn)突變的方法選擇其側(cè)鏈基團(tuán)相似的氨基酸進(jìn)行替換，首先選擇蘇氨酸和甘氨酸進(jìn)行替換，幸運(yùn)的獲得了兩個(gè)內(nèi)部有剪接活性的無(wú)半胱氨酸的HP突變體、pM

7、HPG和pMHPT，為獲得一種通用性的標(biāo)記intein奠定了基礎(chǔ)。
　　 通過(guò)和實(shí)驗(yàn)室的蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行比對(duì)等確定S1、S0和S11三個(gè)斷裂位點(diǎn)，構(gòu)建pMTerNdse-2、pMMD、pMHP、pMHPG和pMHPT對(duì)應(yīng)的S1、S0和S11體內(nèi)斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子。通過(guò)Western Blot檢測(cè)其剪接活性，pMTerNdse-2、pMHP和pMHPG三個(gè)斷裂intein沒(méi)有剪接活性，pMHPT-S1有較高的剪接活性；pMMD-S0

8、有100%的剪接活性。
　　 通過(guò)SWISS MODLE建模，Protean比對(duì)等，從新選擇了其它斷裂位點(diǎn)，pMHP、pMHPG和pMHPT選擇了10個(gè)新的斷裂位點(diǎn)F1-F10，pMMD重新選擇了5個(gè)斷裂位點(diǎn)F1-F5。通過(guò)Western Blot檢測(cè)其體內(nèi)剪接活性，結(jié)果顯示，pMHP-F2和F8有較高的剪接活性；pMHPT只有F2有剪接活性；pMMD只有F4有非常高的剪接活性。
　　 選擇pMHP-F2、pMHP-F8

9、、pMHPT-S1、pMHPT-F2、pMMD-SO、pMMD-F4和pMTX-S1(C1/S)幾個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子，構(gòu)建含有N端前體蛋白或C端前體蛋白相應(yīng)序列的表達(dá)質(zhì)粒，麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)與IN組成的融合蛋白為N端前體蛋白；Ic與硫氧還蛋白(thioredoxin，T)組成的融合蛋白為C端前體蛋白。利用N端前體蛋白帶有的MBP標(biāo)簽可以與Amylose resin特異性結(jié)合，C端前體蛋白

10、帶有的6×組氨酸標(biāo)簽可以與Ni-NTA resin特異性結(jié)合，純化得到用于后續(xù)體外反應(yīng)所需的N端前體蛋白和C端前體蛋白。
　　 將純化的N端前體蛋白與C端前體蛋白在摩爾比為1:1的條件下進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)Western印跡檢測(cè)剪接反應(yīng)的活性，結(jié)果表明，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子pMTX-S1(C1/S)和pMMD-S0有部分剪接活性，其余蛋白質(zhì)內(nèi)含子的體外剪接活性還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 對(duì)有剪接活性的體外斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，我們選

11、擇TXS1在TM系統(tǒng)檢測(cè)其蛋白質(zhì)N端標(biāo)記的應(yīng)用。將TX-SIN構(gòu)建到含有SUMO的PEDHC表達(dá)載體中，體外純化TX-S1N和TX-S1C蛋白，TX-S1N與巰基染料以1:5的比例反應(yīng)4小時(shí)，通過(guò)透析袋透析掉未反應(yīng)的染料，接著SUMO酶與L-X-S1N反應(yīng)1小時(shí)，切除SUMO蛋白，將L-TX-S1和TX-S1C在體外剪接Buffer內(nèi)反應(yīng)3小時(shí)，SDS-PAGE檢測(cè)，利用波長(zhǎng)346-442納米的紫外觀察拍照。
　　 本課題不僅是

12、對(duì)前人研究的補(bǔ)充，同時(shí)還克服了化學(xué)合成和蛋白質(zhì)標(biāo)記的不足之處，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的N-端特異性位點(diǎn)標(biāo)記。為實(shí)現(xiàn)可控的、特異的、對(duì)目標(biāo)蛋白影響小的對(duì)目標(biāo)蛋白的標(biāo)記及實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了一種非常有意思的現(xiàn)象：pMHP和pMMD內(nèi)部一個(gè)非保守區(qū)的半胱氨酸竟然可以決定蛋白質(zhì)內(nèi)含子的活性，目前沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，其化學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)理值得繼續(xù)研究，相信是蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接理論知識(shí)的很好補(bǔ)充。另外，獲得了兩個(gè)活性非常高的內(nèi)部無(wú)半胱氨酸的蛋白