新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接系統(tǒng)的建立及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是前體蛋白質(zhì)中的一段插入序列，被認(rèn)為是基因內(nèi)含子(intron)在蛋白質(zhì)水平上的等效物質(zhì)，它通過(guò)催化蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)將自身從前體蛋白質(zhì)中剪切出來(lái)，并將兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子序列（N-端蛋白質(zhì)外顯子和C-端蛋白質(zhì)外顯子）以天然肽鍵連接。斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split-intein)是蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂形式，表達(dá)前體蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框被分裂成了兩個(gè)基因，斷裂位點(diǎn)是在蛋白質(zhì)內(nèi)含子的序列內(nèi)，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子因此得名。N-端

2、蛋白質(zhì)外顯子(EN)與斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端(IN)形成的融合蛋白，稱(chēng)為N-端前體蛋白質(zhì)。斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端(IC)與C-端蛋白質(zhì)外顯子(EC)形成的融合蛋白，稱(chēng)為C-端前體蛋白質(zhì)。分離的IN與IC能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)相識(shí)別以非共價(jià)鍵結(jié)合，形成有功能的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，從而催化蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)，將兩個(gè)分離的蛋白質(zhì)外顯子(EN、EC)以肽鍵連接。蛋白質(zhì)反式剪接正逐漸成為蛋白質(zhì)工程中的重要工具，已經(jīng)在多肽連接、基因治療等方面得到應(yīng)用。

3、r>　　傳統(tǒng)的S0型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是在靠近蛋白質(zhì)內(nèi)含子中部的位置斷裂，含有較大的N-端和C-端，難于化學(xué)合成。近來(lái)，人們構(gòu)建了新型的S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，斷裂位點(diǎn)是在靠近蛋白質(zhì)內(nèi)含子N-末端的位置，其N(xiāo)-端較小，僅有11個(gè)氨基酸殘基。如果N-端蛋白質(zhì)外顯子也是較小的多肽，人們可以比較容易地化學(xué)合成由N-端蛋白質(zhì)外顯子與S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子N-端形成的N-端蛋白質(zhì)前體，而N-端蛋白質(zhì)外顯子可在人工合成過(guò)程中添加某種修飾基團(tuán)或探針標(biāo)記

4、，在蛋白質(zhì)反式剪接后，N-端蛋白質(zhì)外顯子被連接到目標(biāo)蛋白質(zhì)的剩余部分即C-端蛋白質(zhì)外顯子上，因此修飾基團(tuán)或探針標(biāo)記被隨之添加到了整個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子上。Ssp DnaB S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子已經(jīng)被成功應(yīng)用于體外重組蛋白質(zhì)的N-末端熒光標(biāo)記和動(dòng)物細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的標(biāo)記。此外，人們構(gòu)建了新型的S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，斷裂位點(diǎn)是在靠近蛋白質(zhì)內(nèi)含子C-末端的位置，其C-端較小，僅有6個(gè)氨基酸殘基。同理，如果C-端蛋白質(zhì)外顯子是較小的多肽，可通過(guò)

5、S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接將修飾或標(biāo)記過(guò)的C-端蛋白質(zhì)外顯子連接到目標(biāo)蛋白質(zhì)的C-末端。Ssp GyrB S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子已經(jīng)被用于在重組蛋白質(zhì)的C-末端添加熒光基團(tuán)。S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子、S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接又被稱(chēng)為多肽-蛋白質(zhì)剪接、蛋白質(zhì)-多肽剪接。為蛋白質(zhì)添加熒光基團(tuán)或同位素等探針標(biāo)記在細(xì)胞定位研究、蛋白質(zhì)示蹤方面具有很重要的作用，而化學(xué)修飾（例如非天然的氨基酸）可以有助于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-

6、功能之間的關(guān)系。常規(guī)的添加探針標(biāo)記的化學(xué)方法通常以特定的氨基酸側(cè)鏈（硫醇基、羧基、氨基等）為靶標(biāo)，蛋白質(zhì)中的不同位置可能存在多個(gè)靶標(biāo)，因此會(huì)產(chǎn)生多種混合的修飾性蛋白質(zhì)。用于特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)的其它方法也都具有局限性?；赟1型和S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的蛋白質(zhì)反式剪接是一種新型的具有潛在優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)修飾方法。蛋白質(zhì)反式剪接發(fā)生在目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)，因而保證了標(biāo)記或修飾位點(diǎn)的特異性;此外，這種方法不會(huì)在被修飾的蛋白質(zhì)上殘留大的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，

7、而且由于可以在化學(xué)合成的多肽外顯子上添加任何化學(xué)模體，其應(yīng)用更加具有多樣性。不同的蛋白質(zhì)內(nèi)含子對(duì)于不同蛋白質(zhì)外顯子的剪接效率可能不同，為了更好地實(shí)現(xiàn)上述或其它潛在的利用多肽-蛋白質(zhì)剪接或蛋白質(zhì)-多肽剪接的應(yīng)用，人們需要更進(jìn)一步地探索蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)與其功能的奧秘，并且需要獲得更多種不同的新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子以供選擇。
　　根據(jù)最新的研究報(bào)道，蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX的較大C-端片段(IC)能夠發(fā)生自發(fā)性的C-端斷裂反應(yīng)，而蛋

8、白質(zhì)內(nèi)含子SspDnaB的C-端大片段(IC)不具有這一現(xiàn)象。這種C-端斷裂反應(yīng)是人們意料之外的，關(guān)于此蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)反式剪接的活性有待進(jìn)一步研究。在本論文中，我們的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)內(nèi)含子SspDnaX的N-端片段(IN)存在時(shí)，其IC片段可以與IN發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)，而且蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)的活性抑制了C-端斷裂反應(yīng)的活性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)此IC也能夠與來(lái)源于另外兩種蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接

9、反應(yīng)，表明斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子SspDnaX與其它蛋白質(zhì)內(nèi)含子存在交叉反應(yīng)活性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)即使蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaX的IN被包裹在一個(gè)接近完整的蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，IC仍然能夠與之發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)，揭示此蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN部分可以游離出結(jié)構(gòu)中心的催化口袋，并與IC相互識(shí)別。總之，本研究發(fā)現(xiàn)了一種非常有價(jià)值的可用于多肽-蛋白質(zhì)反式剪接的新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，并且進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的靈活性以及此蛋白質(zhì)內(nèi)含子在活性位

10、點(diǎn)的交叉反應(yīng)活性。
　　蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp GyrB非常具有研究?jī)r(jià)值，因?yàn)檫@個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以被改造成非傳統(tǒng)型的新型斷裂形式即S11型。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)內(nèi)含子SspGyrB也可以改造成為有活性的S1斷裂型，且沒(méi)有檢測(cè)到Ssp GyrBS1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子發(fā)生C-端斷裂的副產(chǎn)物，這與其它一些發(fā)生不同程度副反應(yīng)的蛋白質(zhì)內(nèi)含子相比，具有很大的優(yōu)勢(shì)。此外，在Ssp GyrB蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部添加6×組氨酸標(biāo)簽，不會(huì)阻斷蛋白質(zhì)剪接活性，因

11、此，便于含有該蛋白質(zhì)內(nèi)含子的融合蛋白通過(guò)鎳(Ni)親和層析得到純化。另外，本研究發(fā)現(xiàn)重疊型的SspGyrB蛋白質(zhì)內(nèi)含子也有蛋白質(zhì)反式剪接活性，可能適用于重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)與剪接。由于S0型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂位點(diǎn)在靠近蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的中間位置，可能容易對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)造成破壞，經(jīng)常導(dǎo)致這種斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的其中一個(gè)或兩個(gè)片段與蛋白質(zhì)外顯子形成的融合蛋白錯(cuò)誤折疊或可溶性較差。本研究發(fā)現(xiàn)的Ssp GyrB重疊型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是

12、由S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端和S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C-端組成，即兩個(gè)片段均是接近完整的蛋白質(zhì)內(nèi)含子片段，對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)含子整體結(jié)構(gòu)的破壞較小，發(fā)生錯(cuò)誤折疊的可能性相對(duì)較低。
　　本論文對(duì)另外兩種S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子Rma DnaB、Ssp GyrB的較大C-端片段分別與不同S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N-端片段在大腸桿菌內(nèi)的交叉反應(yīng)活性進(jìn)行了分析檢測(cè)。目的是探討S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)雜交特征是否具有普遍性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S1

13、型蛋白質(zhì)內(nèi)含子Rma DnaB的C-端片段能夠與S1型蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp GyrB的N-端片段交叉反應(yīng)，不能與S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子SspDnaX的N-端片段交叉反應(yīng);與此相似，S1型蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp GyrB的C-端蛋片段能夠與Rma DnaB的N-端片段交叉反應(yīng)，不能與Ssp DnaX的N-端蛋片段交叉反應(yīng)。這表明S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子C-端大片段的交叉反應(yīng)活性具有一定的普遍性，并非Ssp DnaX的C-端大片段獨(dú)有的特征。此外，

14、某些交叉反應(yīng)表現(xiàn)出溫度依賴(lài)性。
　　我們檢測(cè)了多種雜合斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的交叉剪接反應(yīng)活性，對(duì)S1型、S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的體外交叉反應(yīng)進(jìn)行了研究。我們獲得了一個(gè)包含有多種無(wú)交叉反應(yīng)的S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子和S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括多個(gè)S1型、多個(gè)S11型和多個(gè)S1與S11型的混合組合，形成了一個(gè)新的同時(shí)利用多個(gè)斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的蛋白質(zhì)反式剪接系統(tǒng)，我們對(duì)此系統(tǒng)進(jìn)行了模擬應(yīng)用。
　　此系統(tǒng)中多個(gè)新型斷裂蛋白

15、質(zhì)內(nèi)含子在同一體系中的共剪接能夠在蛋白質(zhì)研究及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。例如在某一體系中，當(dāng)人們需要同時(shí)研究多個(gè)蛋白質(zhì)時(shí)，利用多個(gè)新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子共剪接可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的修飾或標(biāo)記。選擇此蛋白質(zhì)反式剪接系統(tǒng)中的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，我們成功模擬了兩種S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的共剪接、兩種S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的共剪接和S11型與S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的共剪接，沒(méi)有發(fā)生非特異性的交叉剪接，證實(shí)了此系統(tǒng)至少在本實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的可行性。

16、r>　　利用無(wú)交叉反應(yīng)的S11型和S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，還可以進(jìn)行內(nèi)部小肽剪接反應(yīng)，從而將小肽剪接到蛋白質(zhì)的內(nèi)部。我們選擇了9組上述系統(tǒng)中的S11型和S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的組合進(jìn)行了內(nèi)部小肽剪接實(shí)驗(yàn)。除了其中一個(gè)組合外其余8種組合均成功將小肽剪接到了蛋白質(zhì)外顯子內(nèi)部。由于中間前體肽較小，容易人工化學(xué)合成，在合成過(guò)程中可以進(jìn)行小肽的修飾或標(biāo)記，通過(guò)S11型和S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)，小肽被剪接到目標(biāo)蛋白質(zhì)的內(nèi)部。因此，斷裂蛋白

17、質(zhì)內(nèi)含子在內(nèi)部小肽剪接方面的應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)內(nèi)部特異位點(diǎn)的修飾或標(biāo)記。
　　上述蛋白質(zhì)反式剪接系統(tǒng)還可以有很多其它方面的應(yīng)用。例如，此系統(tǒng)可以對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)部進(jìn)行同位素探針標(biāo)記，用于核磁共振(NMR)研究。可以在蛋白質(zhì)分子兩端進(jìn)行熒光標(biāo)記或化學(xué)修飾（糖基化、磷酸化等）;有些毒性蛋白無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)完整表達(dá)，也有些蛋白質(zhì)因分子量太大而無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)完整，均可以利用此系統(tǒng)中無(wú)交叉反應(yīng)的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，將目標(biāo)蛋白質(zhì)分多個(gè)小段單獨(dú)表達(dá)后通

18、過(guò)蛋白質(zhì)反式剪接有序連接形成完整的蛋白質(zhì)。熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)在生物大分子相互作用分析、細(xì)胞生理研究、免疫分析等方面有著廣泛的應(yīng)用。但是這種技術(shù)需要為蛋白質(zhì)添加兩個(gè)或更多的熒光探針。利用多個(gè)S1型或S11型的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)分子的特異性標(biāo)記或單個(gè)蛋白質(zhì)分子的多位點(diǎn)特異性標(biāo)記。
　　本論文主要涉及新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的構(gòu)建，蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的雜交反應(yīng)研究，新的蛋白質(zhì)反