利用蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)位點(diǎn)特異性修飾蛋白質(zhì).pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子(Intein)是指前體蛋白中的一段插入序列，它在蛋白質(zhì)翻譯后的成熟過(guò)程中自我催化，使自身從前體蛋白中切除，并將其兩側(cè)的多肽片段(N-端蛋白質(zhì)外顯子和C-端蛋白質(zhì)外顯子)以肽鍵連接，形成成熟的蛋白質(zhì)。截至目前，已經(jīng)有500多種蛋白質(zhì)內(nèi)含子被發(fā)現(xiàn)。典型的蛋白質(zhì)內(nèi)含子包含400多個(gè)氨基酸，不僅具有蛋白質(zhì)剪接功能，還有核酸轉(zhuǎn)移酶活性。而微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子只有140個(gè)氨基酸左右，并且只有蛋白質(zhì)剪接功能。這兩類蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接反應(yīng)稱為

2、蛋白質(zhì)順式剪接反應(yīng)(cis-splicing)。斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split-intein)是微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂形式，每個(gè)斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子包括兩個(gè)片段：N-端蛋白質(zhì)內(nèi)含子(IN)和 C-端蛋白質(zhì)內(nèi)含子(IC)，這兩個(gè)片段表達(dá)后可以相互識(shí)別并發(fā)生蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)，稱這類蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)為反式剪接反應(yīng)(trans-splicing)。由于斷裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的兩個(gè)片段可以分別與其兩端的外顯子獨(dú)立表達(dá)后在體外將它們剪接起來(lái)，所以這類蛋白質(zhì)內(nèi)含

3、子已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中。例如，這項(xiàng)技術(shù)可以應(yīng)用到蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾、同位素修飾蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)環(huán)化、基因治療、蛋白質(zhì)芯片等研究中。
　　自然界中存在天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，還可以認(rèn)為地將微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子改造成斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子。天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的中部位置斷裂，稱之為S0型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子；新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的斷裂位點(diǎn)靠近微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的 N-端或 C-端，分別稱為 S1(IN~12 aa，

4、 IC~140 aa)或S11(IN~150 aa，IC~6 aa)型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子。而且，由于S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN和S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IC比較小，易于化學(xué)合成，從而簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)修飾和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)斷裂等方面的應(yīng)用。在本論文中，首次獲得Cysteine free(無(wú)半胱氨酸)型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，并基于新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，開(kāi)發(fā)出蛋白質(zhì)N-末端和C-末端的定點(diǎn)修飾方法，同時(shí)對(duì)MBP、GST、SUMO、diUb和

5、ERp44蛋白進(jìn)行定點(diǎn)修飾。
　　在以往的研究中，S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子曾被用于蛋白質(zhì)C-末端修飾，然而這種蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN(IN~150 aa)必須與目的蛋白融合表達(dá)。較大的IN會(huì)影響目的蛋白的正常表達(dá)、折疊和可溶性，從而限制了這種方法的廣泛應(yīng)用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一種新型蛋白質(zhì)C-末端修飾方法：首先對(duì)Ssp GyrB和RmaDnaB S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行基因突變，將這兩種蛋白質(zhì)內(nèi)含子IC(IC~140 aa

6、)中所有半胱氨酸(Cysteine)突變成絲氨酸(Serine)。檢測(cè)這兩種斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接活性，結(jié)果顯示突變后的RmaDnaB S1有剪接活性，突變后的SspGyrBS1無(wú)剪接活性。然后對(duì)突變后的RmaDnaB S1進(jìn)行更深入的體外剪接活性研究，其剪接動(dòng)力學(xué)常數(shù)為5.15±0.27×10-4 s-1，最高剪接效率為84％。為了驗(yàn)證這種方法分別以MBP、GST和SUMO蛋白為目的蛋白進(jìn)行C-末端修飾，檢測(cè)的修飾效率分別為：41.2

7、%、53.4%和66.8%。這種新方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)比較小的 IN(~12 aa)與目的蛋白融合表達(dá)，對(duì)目的蛋白的表達(dá)、折疊和可溶性影響較小；2) IC內(nèi)無(wú)半胱氨酸，且在C-端外顯子上僅有的一個(gè)半胱氨酸。任何有巰基活性的化學(xué)基團(tuán)可以被修飾到此半胱氨酸上，并通過(guò)蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)，定點(diǎn)修飾到目的蛋白C-末端。
　　在以往的研究中，S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以用于蛋白質(zhì)N-末端修飾。在這種方法中，首先采用化學(xué)方法合成IN(IN~12

8、aa)以及N-端外顯子，并將化學(xué)基團(tuán)合成到 N-端外顯子的氨基酸側(cè)鏈上，進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)反式剪接將帶有化學(xué)基團(tuán)的N-端外顯子連接到目的蛋白的N-末端。然而，通常會(huì)遇到帶有化學(xué)基團(tuán)的多肽難溶于水、合成多肽無(wú)剪接活性等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，本論文在大腸桿菌中表達(dá)S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN及其N-端外顯子，并將化學(xué)基團(tuán)定點(diǎn)修飾到外顯子的半胱氨酸側(cè)鏈上，通過(guò)蛋白質(zhì)反式剪接，將化學(xué)基團(tuán)定點(diǎn)修飾到蛋白質(zhì)的N-末端。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，必須保證S1

9、型蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN沒(méi)有半胱氨酸，且在 N-端外顯子中有唯一的半胱氨酸用于化學(xué)基團(tuán)修飾。首先選我們擇TerThyX S1斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，并將其IN中的半胱氨酸突變成絲氨酸，在N-端外顯子中保留唯一的半胱氨酸用于化學(xué)基團(tuán)修飾。這種新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在大腸桿菌體的剪接活性為20%?；谠摰鞍踪|(zhì)內(nèi)含子，我們開(kāi)發(fā)了新的蛋白質(zhì) N-端修飾方法：通過(guò)簡(jiǎn)單的重組表達(dá)、修飾和純化得到帶有熒光基團(tuán)的小肽；蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)結(jié)束后，熒光基團(tuán)被特異的修飾到蛋

10、白質(zhì)的 N-端。為了驗(yàn)證這個(gè)方法，GST蛋白作為目的蛋白進(jìn)行N-端修飾，修飾的效率為12.3%。這種新方法有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：1)不需要化學(xué)合成帶有修飾物的多肽，該步驟復(fù)雜，成本高，特別是需要對(duì)目的蛋白修飾多種化學(xué)修飾物。2)相比化學(xué)合成的多肽，大腸桿菌表達(dá)的多肽片段水溶性好，且剪接活性更高。
　　蛋白質(zhì)多位點(diǎn)的特異性修飾有助于了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，特別是在蛋白的動(dòng)態(tài)構(gòu)像研究方面。為了開(kāi)發(fā)新的蛋白質(zhì)多位點(diǎn)特異性修飾方法，本論文嘗試同

11、時(shí)利用 S1和 S11兩種斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)兩個(gè)位點(diǎn)的特異性修飾。以di-Ub(ubiquitin dimer)蛋白為研究對(duì)象，di-Ub與S1的IC(~140aa)和S11的IN(~150 aa)融合表達(dá)。將兩個(gè)不同的化學(xué)基團(tuán)修飾到S1IN(~12 aa)和S11IC(~6 aa)的外顯子序列上。通過(guò)蛋白質(zhì)重組表達(dá)、修飾和純化以及合成帶有另一種熒光基團(tuán)的小肽，兩種熒光基團(tuán)分別被剪接修飾到靶蛋白的N-端和C-端。這種方法的好處是

12、：1)通過(guò)一步反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)蛋白兩端的特異性修飾，操作方法簡(jiǎn)捷；2)避免了對(duì)靶蛋白進(jìn)行突變改造以及其導(dǎo)致蛋白失活的可能。
　　蛋白質(zhì)剪接技術(shù)還可以為基礎(chǔ)理論研究提供新工具和方法。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留蛋白(ERp44)是二硫鍵異構(gòu)酶家族中的一員ERp44，通過(guò)滯留過(guò)程(Retention process)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。最近的研究顯示，在pH為中性的ER中，ERp44的C-端尾巴會(huì)覆蓋疏水區(qū)域和活性中心，ERp44無(wú)活性；在pH較低的cis

13、Golgi中， C-端尾巴會(huì)舒展開(kāi)，露出底物結(jié)合位點(diǎn)，ERp44有活性。如果ERp44蛋白C-端尾巴可以被同位素或者熒光基團(tuán)定點(diǎn)修飾，ERp44 C-端尾巴的動(dòng)態(tài)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系可以通過(guò)NMR(Nuclear magnetic resonance)和FRET(Fluorescence resonance energy transfer;NMR)等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。為了完成對(duì)ERp44蛋白的片段化同位素標(biāo)記，首先通過(guò)在大腸桿菌體內(nèi)的反式剪接

14、反應(yīng)，篩選到了具有高剪接活性的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子和將其插入到 ERp44蛋白中的位點(diǎn)，即在 ERp44 S350位置插入Cne Prp8斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，剪接效率接近100%。隨后，構(gòu)建應(yīng)用于體外剪接的N-前體蛋白(ERp441-350-IN)和C-前體蛋白(IC-ERp44351-377)。N-前體蛋白在2 YT培養(yǎng)基中表達(dá)，產(chǎn)量為38mg/L培養(yǎng)基，C-前體蛋白在M9培養(yǎng)基中表達(dá)，并且可以在此培養(yǎng)基中引入同位素(15N，14C)，得到

15、標(biāo)記蛋白的產(chǎn)量為16 mg/L培養(yǎng)基。兩種前體蛋白發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)后，剪接產(chǎn)物為完整的ERp44蛋白，剪接效率為84%。在這個(gè)蛋白中1-350 aa為普通蛋白，在NMR檢測(cè)中沒(méi)有信號(hào)。351-377 aa是同位素(15N，14C)修飾的蛋白，可以在NMR中檢測(cè)到信號(hào)。最后，為了完成對(duì)ERp44蛋白C-末端進(jìn)行熒光基團(tuán)修飾用于FRET研究，我們利用RmaDnaB S1蛋白質(zhì)內(nèi)含子的反式剪接反應(yīng)，得到的修飾的效率為95%。此項(xiàng)研究為揭